長鏈非編碼RNA結腸癌相關轉錄物2(CCAT2)在膀胱癌中的表達及作用機制

劉 明，陶思行，譚九峰，陳曉亮，晉學飛，王傳芳，那萬里

(1.四平市中心人民醫院，吉林 四平136000；2.吉林大學中日聯誼醫院；3.榆樹市中醫院)

膀胱癌是常見的泌尿系腫瘤，在我國有較高的發病率[1]。膀胱癌的治療以手術切除為主，并輔以放療、化療，但5年生存率仍不盡如人意[2]。對膀胱癌發病機制不明確是導致其治療效果不佳的主要原因。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度超過200 核苷酸的不編碼蛋白質的RNA，其可在基因組轉錄水平、基因組轉錄后水平及表觀遺傳學等層面調控基因表達，進而參與惡性腫瘤的發生與發展[3]。lncRNA結腸癌相關轉錄物2(CCAT2)是位于人類染色體8q24的lncRNA，最早發現于結腸癌中，并被證實可促進結腸癌的增殖和遷移[4]。近年來研究發現，CCAT2在多種惡性腫瘤中都發揮重要調控作用，如前列腺癌[5]、非小細胞肺癌[6]、胃癌[7]等。但CCAT2與膀胱癌的相關研究未見報道。本研究旨在觀察CCAT2在膀胱癌中的表達，并通過干預CCAT2表達研究其對膀胱癌細胞增殖、凋亡和遷移的影響，以期為膀胱癌的防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 組織標本采集選取2018年1月至2018年12月我院行手術切除的50例膀胱癌患者癌組織樣本和癌旁組織樣本(距離腫瘤組織邊緣>5 cm)，患者術前均未接受放化療治療。本研究經醫院倫理學委員會審批通過，患者均簽署知情同意書。

1.2 細胞系和主要試劑人正常膀胱上皮細胞sv-HUC-1、膀胱癌細胞株EJ、BIU87、T24、T24-ADM購于美國ATCC；DMEM培養基、PBS緩沖液、胰蛋白酶、胎牛血清購于Hyclone公司；RT-PCR試劑、Bax單克隆抗體、Bcl-2單克隆抗購于大連Takara公司；Western blot試劑盒購于南京建成生物有限公司；LipofectamineTM 2000脂質體轉染試劑購于Invitrogen公司；CCK8試劑盒購于碧云天試劑有限公司。

1.3 細胞培養與轉染常規復蘇細胞，用含有10%胎牛血清+1%雙抗的DMEM培養液重懸浮細胞，并置于37℃、5% CO2培養箱中培養，每天換液1次。收集對數生長期的細胞，接種于細胞培養板中，細胞濃度為2×106cells/孔，采用LipofectamineTM 2000用siRNA-NC、siRNA-CCAT2對細胞進行轉染，細胞置于于37℃、5% CO2培養箱中培養24 h。

1.4 qRT-PCR檢測CCAT2表達參照Trizol試劑盒說明書提取組織/細胞中總RNA，利用反轉錄試劑盒逆轉錄總RNA至cDNA，以此cDNA為模板并根據SYBR Premix ExTaqTM說明書行qRT-PCR，用公式2-△△CT計算CCAT2的相對表達。CCAT2引物序列：上游5’-CCCTGGTCAAATTGCTTAACCT-3’，下游5’-TTATTCGTCCCTCTGTTTTATGGAT-3’；GAPDH引物序列：上游5’-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3’，下游5’-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3’。

1.5 CCK-8檢測細胞增殖收集轉染后細胞，并接種于96孔板中，細胞終濃度為2×106cells/孔，分別培養24 h、48 h、72 h、96 h時，棄去細胞培養液，每孔加入10 μl的CCK-8溶液，孵育10 min，用全自動酶標儀測定波長OD450 nm處光密度值。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡收集轉染后細胞，將細胞置于37℃、5% CO2條件中繼續培養48 h，采用凋亡試劑盒(Annexin-V/PI)進行避光染色，1 h后上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。細胞凋亡率=[(右上象限細胞+右下象限細胞)/總細胞數]×100%。

1.7 劃痕實驗檢測細胞遷移收集轉染后細胞，將細胞置于37℃、5% CO2條件中繼續培養，待細胞融合率達到90%左右時，用200 μl槍頭垂直于6孔板底部做橫線劃痕，之后細胞繼續置于恒溫培養箱(37℃、5% CO2)中培養，培養后24 h，于倒置光學顯微鏡下拍照(×100)觀察，利用Image J軟件測量劃痕區域寬度，并計算細胞劃痕愈合率。

1.8 Western blot法檢測凋亡相關蛋白表達收集轉染后細胞，蛋白提取試劑盒提取細胞蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測樣品蛋白濃度，取200 μl樣品行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，4℃封閉4 h，后依次加入1∶2 000濃度I抗(兔抗人Bcl-2和兔抗人Bax)、1∶500濃度HRP標記的羊抗兔II抗，按ECL試劑盒說明書行電化學發光檢測。

1.9 統計學方法采用SPSS20.0分析數據，計量資料用均值±標準差表示，多組間比較用單因素方差檢驗，兩兩間比較用LSD-t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CCAT2在膀胱癌組織及細胞中的表達分析

CCAT2在膀胱癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)(見圖1A)；與sv-HUC-1細胞比較，CCAT2在EJ、BIU87、T24、T24-ADM細胞中的表達明顯增高(P<0.05)，其中以EJ、BIU87細胞最高(見圖1B)。

2.2 轉染siRNA-CCAT2對膀胱癌細胞中CCAT2表達的影響

圖1A 膀胱癌組織及癌旁組織中CCAT2表達水平比較 圖1B 正常膀胱細胞及膀胱癌細胞中CCAT2表達水平比較

注：與癌旁組織比較，***P<0.05 注：與正常膀胱細胞比較，***P<0.05

選取CCAT2表達水平最高的兩株膀胱癌細胞EJ、BIU87為對象，并分別轉染轉染siRNA-NC和siRNA-CCAT2，采用qRT-PCR檢測細胞中CCAT2表達。與轉染siRNA-NC相比較，轉染siRNA-CCAT2后細胞中CCAT2表達顯著降低(P<0.05)(見圖2)。

2.3 轉染siRNA-CCAT2對膀胱癌細胞增殖的影響

CCK8結果顯示：與轉染siRNA-NC相比較，轉染siRNA-CCAT2后EJ、BIU87細胞增殖活性均顯著降低(P<0.05)(見圖3A、3B)。

2.4 轉染siRNA-CCAT2對膀胱癌細胞凋亡的影響

流式結果顯示：與轉染siRNA-NC相比較，轉染siRNA-CCAT2后EJ、BIU87細胞凋亡率均顯著增高(P<0.05)(見圖4)。

圖2 轉染siRNA-CCAT2對膀胱癌細胞中CCAT2表達的影響

注：與轉染siRNA-NC比較，***P<0.05

圖3A轉染siRNA-CCAT2對EJ細胞增殖的影響 圖3B 轉染siRNA-CCAT2對BIU87細胞增殖的影響

注：與轉染siRNA-NC比較，***P<0.05 注：與轉染siRNA-NC比較，***P<0.05

2.5 轉染siRNA-CCAT2對膀胱癌細胞遷移的影響

流式結果顯示：與轉染siRNA-NC相比較，轉染siRNA-CCAT2后EJ、BIU87細胞遷移能力均顯著減弱(P<0.05)(見圖5)。

2.6 轉染siRNA-CCAT2對膀胱癌細胞凋亡相關蛋白表達的影響

流式結果顯示：與轉染siRNA-NC相比較，轉染siRNA-CCAT2后EJ、BIU87細胞Bcl-2蛋白表達顯著減少，而Bax蛋白表達顯著增高(P<0.05)(見圖6)。

圖4 轉染siRNA-CCAT2對EJ、BIU87細胞凋亡的影響

圖5 轉染siRNA-CCAT2對EJ、BIU87細胞遷移的影響

圖6A轉染siRNA-CCAT2對EJ細胞凋亡相關蛋白表達的影響 圖6B轉染siRNA-CCAT2對BIU87細胞凋亡相關蛋白表達的影響

注：與轉染siRNA-NC比較，***P<0.05 注：與轉染siRNA-NC比較，***P<0.05

3 討論

lncRNAs與癌癥密切相關。膀胱癌中存在多種lncRNAs的異常表達，如ZFAS1[8]、H19[9]、HOTAIR[10]等，對膀胱癌的發生發展起著重要作用。CCAT2是近年來新發現的一類lncRNA。Qiu等[11]研究發現，CCAT2在非小細胞肺癌組織中表達顯著高于癌旁正常組織，平均上調7.5倍。Huang等[12]研究證實，CCAT2在卵巢癌組織和細胞系中均呈高表達，CCAT2高表達者其總體生存期明顯短于低表達者(P<0.05)，且CCAT2表達與FIGO分期、腫瘤分級及遠處轉移呈正相關。本研究中，我們通過觀察膀胱癌組織和細胞系中CCAT2表達變化發現，CCAT2在膀胱癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)，且多株膀胱癌細胞中CCAT2表達均明顯高于膀胱正常上皮細胞(P<0.05)。上述結果表明，CCAT2在包括膀胱癌在內的多種惡性腫瘤中呈高表達，其表達上調與腫瘤發生發展密切相關。

為進一步驗證CCAT2在膀胱癌中的作用，我們選取了CCAT2表達量最高的兩株膀胱癌細胞EJ、BIU87為對象，觀察沉默CCAT2對細胞增殖、遷移及凋亡的影響。結果發現：與轉染siRNA-NC相比較，轉染siRNA-CCAT2可使得膀胱癌細胞中CCAT2表達明顯下調，同時顯著抑制細胞增殖活性及細胞遷移能力(P<0.05)，表明CCAT2高表達是促使膀胱癌細胞增殖和遷移的主要原因之一。類似現象，也已在肝癌[13]、膠質瘤[14]中得到證實。流式結果顯示，轉染siRNA-CCAT2后膀胱癌細胞凋亡率明顯提高，與轉染siRNA-NC相比差異顯著(P<0.05)，表明CCAT2是一種膀胱癌細胞生長正調控因子，扮演著“促癌基因”作用，這與CCAT2在其他腫瘤中的作用相一致[15，16]。因此，深入研究CCAT2促進膀胱癌細胞生長機制對于膀胱癌的防治具有重要意義。

凋亡過程的啟動與細胞的“命運”息息相關，而Bcl-2/Bax比值是啟動細胞凋亡的“分子開關”。Bcl-2、Bax是凋亡網絡中的核心蛋白，其中Bcl-2具有抑制細胞凋亡作用，而Bax則可促進細胞凋亡。Bcl-2/Bax比值決定了異二聚體(Bcl-2/Bax)與同二聚體(Bax/Bax)的比值，是反映細胞凋亡水平的重要指標[17]。當Bcl-2過度表達或Bax表達降低，則易形成Bcl-2/Bax異二聚體，從而抑制細胞凋亡；反之，當Bcl-2表達下調或Bax表達增高，則可形成Bax/Bax同二聚體，誘導細胞凋亡發生[18]。本研究結果顯示，與轉染siRNA-NC相比較，轉染siRNA-CCAT2后膀胱癌細胞Bcl-2蛋白表達顯著減少，而Bax蛋白表達顯著增高(P<0.05)。上述結果提示，沉默CCAT2可下調Bcl-2表達，同時上調Bax表達，使得Bcl-2/Bax比值降低，而這也是其促進膀胱癌細胞凋亡的可能機制之一。

綜上所述，CCAT2在膀胱癌組織和細胞中高表達，沉默CCAT2可抑制膀胱癌細胞增殖和遷移，并促進膀胱癌細胞凋亡，其機制可能與調控Bcl/Bax比率有關。