miR-23b-3p靶向PALM3對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡及炎癥因子表達的影響

戴彩同，張少鋒，黃玉潔

(1.廣東省惠州市第六人民醫院 呼吸內分泌科,廣東 惠州516200；2.廣東醫科大學附屬醫院 呼吸科,廣東 湛江524000)

肺泡上皮由Ⅰ型和Ⅱ型上皮細胞組成，Ⅱ型肺泡上皮細胞的更新能力有助于維持肺泡的完整，參與肺免疫和炎癥反應[1]。肺炎鏈球菌是肺炎的最主要病原菌，導致肺泡上皮細胞凋亡和產生炎癥，針對其凋亡和炎癥的機制探討可助于預防和治療肺炎。

研究表明，PALM3在脂多糖(LPS)誘導大鼠急性肺損傷模型中肺組織內的表達增加，干擾PALM3 表達能減輕LPS誘導的大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞炎癥反應[2]。而本研究通過生物信息學預測發現，paralemmin-3(PALM3)可能是miR-23b-3p的靶基因。miR-23b-3p對冠狀動脈內皮細胞[3]和H2O2誘導的血管內皮細胞HUVECs[4]起保護作用。但miR-23b-3p在肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞中的表達及作用還尚未可知。

本研究通過建立A549細胞的肺炎鏈球菌模型，研究miR-23b-3p對肺炎鏈球菌誘導的A549細胞炎癥和凋亡的影響，并探討PALM3在此機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

肺泡上皮細胞A549和肺炎鏈球菌株ATCC BAA-255購自美國ATCC；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和RPMI-1640培養基購自美國Gibco公司；胰蛋白酶和肝素購自Sigma-Aldrich公司；引物、miR-23b-3p 模擬物(miR-23b-3p)、抑制劑(anti-miR-23b-3p)、PALM3過表達載體(pcDNA-PALM3)、PALM3抑制劑(si-PALM3)、空載體和對照物(pcDNA、miR-NC、anti-miR-NC和si-NC)及PALM3突變型和野生型雙熒光素酶載體購自蘇州吉瑪基因；Total RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒(RT-PCR)、real-time PCR 試劑盒和Lipofectamine 2000轉染試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；PALM3抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體和GAPDH抗體購自英國Abcam公司；白介素-6(interleukin 6，IL-6)和白介素-10(interleukin 10，IL-10)ELISA檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；雙熒光素酶報告系統(Dual-Luciferase Reporter Assay System)購自美國Promega公司；雙染色流式法細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；流式細胞儀購自美國BD公司，全自動酶標儀和Real-time PCR儀購自美國Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1細胞和肺炎鏈球菌培養[5]

將A549細胞培養在含有10 %胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養基中，在37 ℃ 5% CO2恒溫密閉培養箱中培養，消化傳代。

肺炎鏈球菌培養于含5%脫纖維羊血的血平板中，將實驗開始前于托休二氏溶液(含0.5%酵母)中培養過夜。

1.2.2細胞處理和實驗分組[5]

將A549細胞分為對照組、感染組、轉染組和感染組+轉染組。對照組：用RPMI-1640K培養基正常培養；感染組：將A549培養至融合度達到90%左右時，然后用1×108CFU/mL的肺炎鏈球菌培養A549細胞；轉染組：將不同載體或對照轉染A549細胞48 h；感染組+轉染組：細胞先進行轉染48 h，然后用1×108CFU/mL的肺炎鏈球菌培養轉染的A549細胞。

1.2.3細胞轉染和RNA提取

當A549細胞培養至融合度為80%時，根據轉染試劑盒說明書進行進轉染。轉染分組：miR-23b-3p過表達組：轉染miR-NC和miR-23b-3p；miR-23b-3p抑制組：轉染anti-miR-NC和anti-miR-23b-3p；PALM3抑制組：轉染si-NC和si-PALM3；miR-23b-3p和PALM3雙過表達組：轉染miR-23b-3p+pcDNA和miR-23b-3p+pcDNA-PALM3；PALM3野生型和突變型的雙熒光素酶報告系統組：分別轉染WT-PALM3+miR-NC，WT-PALM3+miR-23b-3p，MUT-PALM3+miR-NC和MUT-PALM3+miR-23b-3p。將上述載體或片段轉染培養好的A549細胞，轉染48 h后收集細胞。

收集轉染過和/或肺炎鏈球菌感染的A549細胞，提取細胞總RNA，以RNA為模板反轉錄合成cDNA，再以cDNA為模板根據 Real-time PCR試劑盒的說明書合成PALM3 mRNA和miR-23b-3p；反應程序為：94℃5 min；94℃40 s、59℃30 s、72℃42 s，40個循環；72℃10 min。用2-ΔΔCt法進行數據分析。

1.2.4流式細胞術測定細胞凋亡率

收集各組轉染或/和感染的A549細胞并將細胞稀釋為1×105個/mL，取100 μl 1×Binding buffer重懸細胞，然后根據凋亡試劑盒說明書，加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl碘化丙啶(propidium iodide,PI)，室溫避光20 min，再加入400 μl 1×Binding buffer，上流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.2.5檢測細胞中IL-6和IL-10的含量

收集各組A549細胞的培養上清，按照IL-6和IL-10試劑盒說明書操作，檢測細胞培養上清中IL-6和IL-10的含量。

1.2.6雙熒光素酶報告系統實驗

按照1.2.3的步驟進行A549細胞培養和轉染。將構建好的含有miR-23b-3p與PALM3預測結合位點的野生型(WT-PALM3)和突變型(MUT-PALM3)雙熒光素酶報告載體，分別與miR-NC或miR-23b-3p共轉染A549細胞。轉染48h，收集并裂解細胞，離心收集上清，根據雙熒光素酶報告系統試劑盒說明書進行操作，以海腎熒光素酶活性為內參照，檢測相對螢火蟲熒光素酶活性。

1.2.7Western blot檢測PALM3和凋亡相關蛋白

收集A549細胞，裂解細胞并超聲破碎，收集蛋白，每個蛋白樣本進行SDS-PAGE分離蛋白條帶，轉PVDF膜，室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗(PALM3抗體 1:2000，Bcl-2抗體 1∶4000，Bax抗體 1∶3000，GAPDH抗體1∶5000)，4℃孵育過夜，洗膜2次，加入稀釋的酶標二抗，室溫孵育2 h，顯影，以GAPDH為內參照，分析蛋白百度水平。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 miR-23b-3p和PALM3在肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞A549中的表達

與對照組相比，肺炎鏈球菌感染組肺泡上皮細胞A549中miR-23b-3p含量明顯降低(P<0.05)，PALM3的mRNA和蛋白水平明顯升高(P<0.05)，見圖1和表1。

圖1 PALM3蛋白表達

表1 miR-23b-3p和PALM3在肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞中的表達

注：與對照組比較，*P<0.05

2.2 miR-23b-3p過表達對肺炎鏈球菌誘導的A549細胞凋亡和炎癥因子表達的影響

與對照組相比，感染組A549中細胞凋亡率升高(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax表達升高(P<0.05)，上清液中IL-6增多且IL-10減少，差異均具有統計學意義(P<0.05)；與感染組+miR-NC組相比，感染組+miR-23b-3p組A549細胞中miR-23b-3p含量顯著升高，細胞凋亡率降低，IL-10和Bcl-2蛋白水平升高，IL-6和Bax水平降低，差異均具有統計學意義(P<0.05)，見圖2和表2。說明肺炎鏈球菌可誘導A549細胞凋亡和炎癥反應；過表達miR-23b-3p可抑制肺炎鏈球菌誘導的A549細胞凋亡和炎癥。

圖2 miR-23b-3p過表達對肺炎鏈球菌誘導的A549細胞凋亡的影響

表2 miR-23b-3p過表達對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥因子表達的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與感染組+miR-NC組比較，#P<0.05

2.3 干擾PALM3表達對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥因子表達的影響

與感染組+si-NC組相比，感染組+si-PALM3組A549細胞中PALM3含量顯著降低，細胞凋亡率降低，IL-10和Bcl-2蛋白水平升高，IL-6和Bax蛋白水平降低，差異均具有統計學意義(P<0.05)，見圖3和表3。說明干擾PALM3表達可抑制肺炎鏈球菌誘導的A549細胞凋亡和炎癥。

圖3 干擾PALM3表達對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞A549凋亡的影響

表3 干擾PALM3表達對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥因子表達的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與感染組+si-NC組比較，#P<0.05

2.4 miR-23b-3p靶向調控PALM3的表達

通過TargetScan預測發現，PALM3的3’UTR中含有與miR-23b-3p互補的序列，見圖4A。雙熒光素酶報告系統結果如表4所示，過表達miR-23b-3p可使野生型WT-PALM3的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著降低(P<0.05)；而突變型MUT-PALM3的熒光素酶相對活性無明顯變化。Western blot實驗結果表明，過表達miR-23b-3p可下調PALM3表達量；抑制miR-23b-3p表達則上調PALM3表達量，差異均具有統計學意義(P<0.05)，見圖4B和表5。說明miR-23b-3p靶向負調控PALM3的表達。

圖4 miR-23b-3p靶向調控PALM3的表達

表4 雙熒光素酶報告實驗

注：與miR-NC組比較，*P<0.05

表5 miR-23b-3p調控PALM3的表達

注：與miR-NC組比較，*P<0.05；與anti-miR-NC組比較，#P<0.05

2.5 PALM3過表達逆轉了miR-23b-3p過表達對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥因子表達的作用

為確認miR-23b-3p是否通過PALM3影響肺炎鏈球菌誘導的A549細胞凋亡和炎癥，過表達miR-23b-3p的同時過表達PALM3表達。結果表明，與結果2.2一致，過表達miR-23b-3p可抑制肺炎鏈球菌誘導的A549細胞凋亡和炎癥；與感染組+miR-23b-3p+pcDNA組比較，感染組+miR-23b-3p+pcDNA-PALM3組A549細胞中PALM3表達升高，細胞凋亡率升高，IL-10和Bcl-2的水平降低，IL-6和Bax蛋白水平升高，差異均具有統計學意義(均P<0.05)，見圖5和表6。說明過表達PALM3逆轉了過表達miR-23b-3p對肺炎鏈球菌誘導的A549細胞凋亡和炎癥的作用。

圖5 PALM3過表達逆轉了miR-23b-3p過表達對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡的作用

3 討論

研究表明，Paralemmin-3(PALM3) 在脂多糖(LPS)誘導的小鼠急性肺損傷(acute lung injury，ALI)組織中表達上調，而干擾PALM3表達可降低小鼠肺損傷死亡率，鼻內應用特異性siRNA抑制PALM3對LPS誘導的ALI具有保護作用[6]。ALI大鼠模型中，下調palm3可提高生存率，減輕肺組織病理改變，減輕肺水腫、肺血管滲漏和中性粒細胞浸潤，抑制促炎性細胞因子的產生，抑制核因子κB和干擾素β調節因子3的活化，促進大鼠肺泡灌洗液分泌[7]。在LPS刺激后，PALM3可以與肺泡巨噬細胞(alveolar macrophages，AMs)中的Toll樣受體4(TLR4)、髓細胞分化因子88、白細胞介素(IL)-1受體相關激酶-1、腫瘤壞死因子受體相關因子-6、以及含有適配器分子-2的Toll-IL-1受體相互作用，促進AMs中LPS誘導的炎癥反應，并參與了LPS-TLR4信號的傳遞[8]。以上研究結果均說明，PALM3在肺損傷中表達上調，促進炎癥反應。本研究通過肺炎鏈球菌感染肺泡上皮細胞A549，結果表明，感染組PALM3的mRNA和蛋白水平明顯升高，IL-6、Bax水平及細胞凋亡率明顯升高，IL-10、Bcl-2含量明顯降低，干擾PALM3表達可抑制肺炎鏈球菌誘導的A549細胞凋亡和炎癥，與上述結果一致[6,7]，PALM3參與肺炎的發生。

表6 PALM3過表達逆轉了miR-23b-3p過表達對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥因子表達的作用

注：與感染組+miR-NC組比較，*P<0.05；與感染組+miR-23b-3p+pcDNA組比較，#P<0.05

此外，本研究通過TargetScan預測發現，PALM3的3’UTR中含有與miR-23b-3p互補的位點，提示PALM3可能是miR-23b-3p的靶基因，miR-23b-3p可能靶向PALM3參與對肺炎鏈球菌誘導的A549凋亡和炎癥的調控過程。研究表明，miR-23b-3p在肝癌[9]、食管鱗狀細胞癌[10]和胃癌[11]中表達異常，與癌癥的惡性進展、癌細胞的增殖和轉移或化療抗藥性有關。miR-23b-3p在非小細胞肺癌患者中的表達顯著增加，與患者總體低生存率相關[12,13]。miR-23b-3p在肺炎中的研究較少。本研究結果發現，miR-23b-3p在肺炎鏈球菌誘導的A549中水平顯著降低，過表達miR-23b-3p表達可減輕肺炎鏈球菌誘導的A549細胞炎癥并抑制細胞凋亡，說明miR-23b-3p在肺炎鏈球菌誘導的A549細胞炎癥中發揮保護作用。

本研究通過雙熒光素酶報告系統和Western blot結果發現，miR-23b-3p靶向負調控PALM3的表達；過表達PALM3逆轉了過表達miR-23b-3p對肺炎鏈球菌誘導的A549細胞凋亡和炎癥的作用，驗證了在肺炎鏈球菌誘導的A549中miR-23b-3p靶向調控PALM3發揮作用。

綜上所述，在肺炎鏈球菌誘導的A549中，miR-23b-3p表達下調，PALM3表達上調，肺炎鏈球菌可能通過下調miR-23b-3p靶向PALM3誘導A549細胞的炎癥發生和促進細胞凋亡。miR-23b-3p和PALM3可能是肺炎鏈球菌所致肺炎的潛在靶點。