佳木斯地區原發性高血壓合并高尿酸血癥與MTHFR基因多態性的相關性研究

隋小芳，華玥祺，鄒玉敏，苑露丹，費秀斌，劉春輝，黃佳濱，姜秀政，王鳳玲*

(1.佳木斯大學附屬第一醫院 健康管理體檢中心，黑龍江 佳木斯154002；2.佳木斯大學研究生部；3.佳木斯大學附屬第一醫院 消毒供應科；4.佳木斯大學附屬第一醫院 老年病科)

原發性高血壓(Essential hypertension,EH)和高尿酸血癥(Hypemricemia,HUA)在全世界范圍內都是較為常見的慢性疾病，這兩種疾病在我國的患病率呈逐年增加趨勢[1,2]。目前對于亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)基因多態性與疾病的相關性研究多為單種疾病的研究，而EH合并HUA共病的研究較為缺乏。本研究對MTHFR基因多態性與EH合并HUA共病之間的相關性進行了研究，為該基因在EH合并HUA共病診斷和治療的應用奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本項研究收集2017年6月至2018年7月間，在佳木斯大學附屬第一醫院就診及體檢中心體檢的人群為研究對象，共納入符合入組標準的受試者共392例，其中EH組109人，HUA組86人，EH合并HUA組95人，健康對照組102人。各組入組人群均為符合相關指南診斷標準的成年人，并簽署了知情同意書。

排除標準：痛風患者、肝腎功能不全者、近期服用過氫氯噻嗪等可影響血尿酸藥物者、甲亢或甲減患者、孕婦及哺乳期婦女。

1.2 主要實驗儀器和試劑

基因組DNA提取試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)、限制性內切酶MIuI(北京擎科生物有限公司)、HRM Light Scanner TMHR-I 96儀和LC-greenPLUS飽和熒光染料(美國Idaho公司)、PCR儀C-1000(美國Bio-Rad公司)。

1.3 樣本資料采集和DNA制備

記錄受試者的性別、年齡、標準化測量的血壓、生化指標(尿酸、血漿同型半胱氨酸、空腹血糖等)等資料。此外，在獲得受試者的允許后使用標準EDTA抗凝管收集5 ml靜脈血，儲存于-20℃冰箱。待所有血樣集齊后統一提取DNA，使用Nanodrop ND-1000分光光度計進行濃度和純度的測定，最后將樣本DNA的濃度用ddH2O標化至90-120 ng/μL之間，置于4 ℃的環境中保存備用。

1.4 MTHFR 的HRM基因分型

1.4.1設計引物 使用NCBI數據庫查詢MTHFR C677T SNP位點所在的DNA序列，結合Primer Premier5.0和Oligo6.0軟件進行引物設計：上游引物序列：GGAGAAGGTGTCTGCGGGAG；下游引物序列：CAAAGAAAAGCTGCGTGATGATGA。

1.4.2PCR反應 PCR擴增選用10 μl體系，按要求配置好后封存待用。PCR的擴增條件為：95 ℃預變性時長3 min；95 ℃變性時長20 s，64.1 ℃復性時長20 s，72 ℃延伸時長4 s，再將第2-4步重復45個循環。

1.4.3PCR擴增產物的HRM分析 PCR流程完成后再72 ℃延伸1 min，95 ℃變性1 min，95℃復性1 min，重復2個循環，將產物移入到專用96孔掃面板中，在離心機內以8 000 rpm的轉速離心5 min后取出產物，再將其放入Light Scanner儀中進行高溫信號采集。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 各組研究對象的一般情況

本研究的4個實驗組中研究對象的年齡和性別構成無顯著差異，P>0.05。(見表1)

2.2 MTHFR C677TSNP位點哈迪溫伯格平衡檢驗

將各實驗組的MTHFR C677T基因多態性分布情況分別進行哈迪溫伯格平衡檢驗，發現本研究所有SNP位點的基因型頻率均符合HWE(P>0.05)，說明本研究入組人群具有群體代表性。(見表2)

表1 各實驗組研究對象年齡和性別構成的比較

注：P<0.05，有統計學意義。

表2 MTHFR C677T基因多態性的哈迪溫伯格平衡分析

注：P>0.05，群體具有代表性。

2.3 各實驗組MTHFR C677T基因的基因型和等位基因的分布

2.3.1各實驗組 MTHFR C677T基因的基因型和等位基因的分布情況

MTHFR C677T基因多態性的基因型和等位基因在各組的分布情況結果見表3，通過觀察我們發現各組中MHTFR C677T基因的CT、TT基因型頻率及T等位基因頻率均高于對照組，CC基因頻率低于對照組。

2.3.2各實驗組間MHTFR C677T基因的基因型與等位基因頻率的比較在顯性模型(CCv.s.CT+TT)中，我們將各組進行兩兩比較，結果見表3。與對照組相比，EH組CC基因型頻率低于對照組(18.63% vs.34.96%)，而CT、TT基因型頻率(50.98% 、30.39%)比對照組(44.95% 、20.18%)均高，且差異顯著，P=0.008；等位基因T頻率(55.88%)顯著高于對照組(42.66%)，P=0.007。HUA組CC基因型頻率(16.28%)顯著低于對照組(34.96%)，其CT、TT基因型顯著高于對照組(50%v.s.44.95% ，33.72%v.s.20.18%)，P=0.004；T等位基因頻率明顯高于對照組(58.72%vs.42.66%)，P=0.002。EH+HUA組CT、TT基因型顯著高于對照(51.57%、35.79%v.s.44.95%、20.18%)，CC基因型顯著低于對照組(12.63%v.s.34.96%)，P<0.001；T等位基因頻率(61.57%)明顯高于對照組(42.66%)，P<0.001。而各實驗組間比較其差異無統計學意義，P>0.0083。(見表3)

表3 顯性模型中各組MTHFR C677T基因的基因型和等位基因頻率分布及比較

注：4個組間指標的兩兩比較，P需經Bonferroni校正法校正，*P<α’=0.05/6=0.0083有統計學意義。

3 討論

EH及HUA都會增加心腦血管疾病不良事件的發生風險，其存在高患病率、高致殘率、低知曉率、低治療率的現象，使其成為嚴重影響人們健康的慢性疾病[3,4]，當二者并發時心腦血管疾病發生的風險將大大增加[5-7]。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是人體內促進葉酸代謝的一個重要酶，MTHFR C677T基因有3個基因型，分別為CC、CT和TT，攜帶TT和CT基因型的人MTHFR酶活性會分別下降70%和30%[8]，從而影響Hcy的代謝，導致HHcy。

近年以來，國內外已對高血壓及高尿酸血癥的相關基因做了許多研究，但是結果并不一致[9-11]。本研究發現，各實驗組中CT、TT基因型頻率及T等位基因頻率均高于對照組，CC基因頻率低于對照組，而在共病及單獨疾病中的分布差異無統計學意義。這結果表明MTHFR C677等位基因可增加EH合并HUA、EH和HUA的患病風險，在EH或HUA患者中并不會增加患EH合并HUA共病的風險。EH和HUA均是多基因、多因素共同導致的復雜疾病，單基因研究尚不足以獲得陽性結果，需要進一步深入的研究來探討其他基因多態性、以及基因之間的交互作用是否會導致差異性。有研究顯示MTHFR C677T基因檢測可用以指導高血壓精準治療并取得更好的降壓效果[12,13]。而高尿酸血癥與原發性高血壓合并高尿酸血癥的基因研究指導疾病精準治療的效果有待繼續研究。