S1P lyase在肝癌中的表達及對其預后的影響

邱志東，王雪紅，孫維佳，金俊飛

(1.深圳市鹽田區人民醫院 普通外科，廣東 深圳518081；2.桂林醫學院附屬醫院 肝膽胰外科實驗室，廣西 桂林541001;3.中南大學湘雅醫院，湖南 長沙410008)

原發性肝癌(PLC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，其中主要以肝細胞肝癌(HCC，簡稱肝癌)為主，這也是威脅我國公民健康的主要病理類型[1]。盡管近些年來肝癌的診斷和治療水平不斷提高，但是肝癌的總體治療效果仍不盡如人意。因此尋找新的診療靶標具有重要的意義。

干預神經酰胺(Cer)信號通路、抑制細胞死亡是細胞逃逸凋亡、導致腫瘤發生的重要機制之一[2-4]。研究表明Cer的代謝通路與肝癌的發生有密切關系[5,6]。眾所周知，Cer的代謝非常復雜[7]，在Cer代謝過程中，除Cer外，還產生很多與Cer相關的生物活性分子，比如神經鞘磷脂(SM)、神經鞘氨醇(SPH)以及1-磷酸神經鞘氨醇(S1P)等。Cer和Sph能夠抑制細胞生長、促進細胞凋亡，S1P則刺激細胞生長、抑制細胞凋亡[8]。S1P lyase是 S1P裂解酶，其在調控S1P水平中起重要作用[7]。本研究旨在探討S1P lyase在肝癌中的表達及其對肝癌預后的影響。

1 材料與方法

1.1 組織標本和臨床資料

收集54例2015-2019年在桂林醫學院附屬醫院行手術治療的肝癌患者術后標本，所有病例的臨床和病理診斷均為HCC，選取的癌旁組織與癌灶距離>1 cm，記錄患者年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM 分期等臨床數據。54例患者中男性患者45例，女性患者9例，年齡25-72歲，平均年齡(51.54±10.96)，病理分級1級10例、2級27例、3級8例、4級4例，出現轉移40例，無轉移14例，所有患者均在桂林醫學院附屬醫院行手術治療，術前均未進行放、化療，無合并其它腫瘤，腫瘤分期依據采用國際抗癌聯盟第8版TNM分期標準。所有樣本都在樣本離體后第一時間置于液氮，然后迅速置于-80℃冰箱凍存待用。所有肝癌樣本的獲取均取得患者本人及其家屬的同意，并通過桂林醫學院附屬醫院倫理委員會批準。

1.2 實驗試劑

TRIzol 試劑購于Life Technologies (Gaithersburg,MD)，TB Green Premix 購于 TaKaRa(Tokyo,Japan)，FastQuant RT Kit (with gDNase) 購于天根 (中國北京)。

1.3 方法

1.3.1提取組織RNA及real-time PCR剪刀剪取50-100 mg的組織，在樣品組織破碎儀下打碎組織。TRIZOl法提取組織中的總RNA，利用FastQuant RT kit (with gDNase)試劑盒合成cDNA。按照real-time PCR試劑盒的要求進行real-time PCR。每孔的反應體系如下：cDNA 2.0 μl,引物0.1 μM，TB Green Premix 12.5 μl，去酶水9.5 μl。基因表達量采用2(-△△CT) 的相對表達量法，GAPDH作為內參基因(表1)。

表1 引物序列

1.3.2Kaplan-Meier生存分析 根據Kaplan-Meier(www.kmplot.com)的分析結果，以無復發生存率(RFS)來評估S1P lyase在評價肝癌患者生存預后的價值。

1.3.3蛋白互作的網絡構建 將S1P lyase導入到STRING(version 11.0)的數據庫，得到一個蛋白質相互作用網絡(PPI)。利用軟件參數將神經鞘脂信號通路相關蛋白標出。

1.3.4統計學分析 利用SPSS 20.0軟件對實驗數據進行分析。以配對t檢驗、獨立樣本t檢驗及方差分析評價定量的實驗數據，P<0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 S1P lyase在肝癌組織中的表達顯著低于癌旁組織

我們隨機選取了54例肝細胞癌患者手術切除的癌及癌旁組織，采用real-time PCR 檢測S1P lyase在肝癌及癌旁組織中的表達水平。結果顯示(見圖1)，S1P lyase在肝癌組織中的表達明顯低于癌旁組織(P<0.05)。

T：肝癌組織，ANLT：癌旁組織，P**<0.05。

2.2 S1P lyase的表達與肝癌臨床病理特征的關系

結合所選取病例的臨床資料，我們進一步分析了S1P lyase的表達與肝癌患者的臨床病理特征的相關性(表2、圖2)。表2結果顯示：S1P lyase mRNA表達水平與腫瘤大小及腫瘤分期相關，差異有統計學意義(P<0.05)，但是與患者年齡、性別、病理分級及轉移無關；圖2A結果顯示，大于10 cm的腫瘤和小于10 cm的腫瘤相比，S1P lyase的表達明顯降低(P**<0.05)，另外，圖2B結果顯示，在肝癌AJCC分期(第8版)為3期及4期的患者中，S1P lyase的表達明顯比1期及2期的患者降低。

2.3 S1P lyase的低表達能夠預測肝癌患者術后的遠期生存率

我們通過Kaplan-Meier分析S1P lyase的表達與肝癌病人預后的相關性(圖3)。結果顯示，S1P lyase表達量越低，肝癌病人預后越差(HR=0.65,P=0.017)。

表2 S1P lyase表達水平與肝癌患者臨床病理特征的關系

注：2個樣本之間的比較運用t檢驗(t)，3個樣本的比較運用方差分析(F)。統計學方法參考文獻[9]。

2.4 潛在與S1P lyase存在相互作用的神經鞘脂信號通路蛋白

我們利用STRING數據庫中預測了與S1P lyase相互作用的蛋白，發現位于網絡節點位置的蛋白多與膜脂代謝、神經鞘脂代謝、神經酰胺代謝、膜脂合成、神經鞘脂合成通路相關。其中S1Plyase與神經鞘脂代謝通路有互作的蛋白有CERS2、CERS4、CERS5、CERS6、SGPP1、SGPP2、ORMDL1、ORMDL2及ORMDL3。

3 討論

在全世界的腫瘤中，肝癌發病率第5位，死亡率第4位[10]。2018年全球新增肝癌病人84.1萬人，死于肝癌患者78.2萬人[10]。而我國肝癌發病病例、死亡病例均占全球總病例數一半以上[11，12]。絕大多數肝癌患者確診時已為中晚期，此類患者手術切除率低，復發率高，生存率低，因此針對中晚期肝癌進行深入研究，尋找除手術之外的治療手段及診療靶點意義重大。

A：S1P lyase表達與肝癌腫瘤體積的關系，P**<0.05；B：S1P lyase表達與肝癌分期的關系，P***<0.01。

圖3 S1P lyase的表達與肝癌病人預后的關系

S1P是神經鞘脂信號通路的重要生物分子，S1P主要通過其5種細胞表面受體(S1PR 1-5)發揮生物學效應[13],通過和相應的受體結合參與血管生成[14-16]及促進細胞的增殖和存活[17，18]。S1P由SK磷酸化SPH生成的,同時又可以被S1P lyase裂解成為乙醇胺和軟脂醛。Uranbileg B等[19]的研究結果發現SK(由SPH合成S1P所需的酶)和S1P lyase(S1P裂解酶)表達均上調的情況下，S1P水平不是增高而是下降，說明S1P lyase是調控S1P水平的關鍵酶。我們的研究結果表明，S1P lyase在肝癌中的表達下降，說明在肝細胞的惡性轉化過程中，S1P lyase可能出現了基因表達的缺失，S1P lyase可能是一種抑癌基因。

然而S1P lyase是在肝癌的早期還是晚期中發揮作用呢？我們進一步的研究發現，S1P lyase的表達與肝癌腫瘤的體積大小及分期相關，體積>10 cm的腫瘤中S1P lyase的表達更低，提示S1Plyase低表達可能促進肝癌細胞的增殖能力。作為調控S1P水平的關鍵酶，S1Plyase表達下降，會引起S1P水平的升高，而S1P水平增高可以促進肝癌細胞的增殖，因此推測S1P lyase可能通過調控S1P水平影響肝癌的增殖。眾所周知，腫瘤的大小通常影響肝癌患者的預后，AJCC第8版肝癌分期更是把多發腫瘤直徑>5 cm設為T3[20,21]，而巨大肝癌的患者常預示著腫瘤已進入晚期階段，治療效果較差，因此S1P lyase水平下降可能在晚期肝癌中發揮更重要的作用。我們的進一步研究結果表明，S1P lyase在AJCC分期3期及4期的患者中表達更低，說明S1P lyase可能在晚期肝癌中發揮作用，S1P lyase表達水平的下降可能在促進肝癌的發展中起重要作用。

與此同時，我們通過Kaplan-Meier分析S1P lyase的表達與肝癌病人預后的相關性。結果顯示，S1P lyase表達量越低，肝癌病人預后越差。因此S1P lyase表達下降可以作為肝癌不良預后的一個重要指標。

然而，作為神經鞘脂信號通路的一個關鍵酶，S1P lyase發揮作用的方式可能不僅僅是直接裂解底物，進而影響S1P水平發揮作用。神經鞘脂信號通路的諸多蛋白可能存在相互作用，進而整體上影響某一種神經鞘脂分子的水平。我們利用STRING數據庫中預測了與S1P lyase相互作用的蛋白，發現位于網絡節點位置的蛋白多與膜脂代謝、神經鞘脂代謝、神經酰胺代謝、膜脂合成、神經鞘脂合成通路相關。其中與神經鞘脂代謝通路相關的蛋白有CERS2、CERS4、CERS5、CERS6、SGPP1、SGPP2、ORMDL1、ORMDL2及ORMDL3。這些蛋白中CERS2、CERS4、CERS5、CERS6為Cer合成酶[22]，SGPP1、SGPP2可以將S1P去磷酸化生成SPH[23]，而ORMDL1、ORMDL2及ORMDL3則能負向調控神經鞘脂代謝通路[24]。

綜上所述，S1P lyase在肝癌中低表達，而S1P lyase 低表達預示著肝癌患者的不良預后，因此S1P lyase可能是中晚期肝癌患者重要的治療靶點。但是本研究僅是對S1P lyase的初步研究，還應從細胞功能實驗及機制研究中進一步探討S1P lyase在肝癌發展中作用及機制。