不同產地何首烏HPLC指紋圖譜研究

【摘? 要】目的：用高效液相色譜法建立何首烏的指紋圖譜，為何首烏的生產提供質量控制方法。方法：采用高效液相色譜法分析，Water X-Terra色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流動相：乙腈-0.1 %磷酸水溶液梯度洗脫，流速為1 ml/min，柱溫：25 ℃，檢測波長：265 nm。分析了十批不同產地何首烏指紋圖譜，得出何首烏藥材的指紋圖譜共有模式。結果：在選定的色譜條件下通過相似度分析確定13個色譜峰構成生首烏藥材指紋圖譜的特征峰。結論：采用HPLC方法所建立的指紋圖譜具有穩定性、重復性好的特點，可以用于何首烏藥材的鑒別和質量控制。

【關鍵詞】何首烏;HPLC;特征圖譜

何首烏來源于蓼科植物何首烏（Polygonum multiflorum Thunb.）的干燥塊根，具有解毒、消癰、截瘧、潤腸通便功效[1]。現代研究表明，何首烏主要含有的二苯乙烯苷類和蒽醌類成分，其中二苯乙烯苷具有降低膽固醇[2]、抗衰老[3-4]、提高免疫功能[5]、防治動脈硬化及保護肝臟等作用[6]，而蒽醌類成分具有潤腸通便，抗菌消炎的功效[7]。

中藥色譜指紋圖譜是一種綜合的、可量化的色譜鑒定手段，可以借以鑒別真偽、評價原料藥材、半成品和成品質量均一性和穩定性。為了更好的建立何首烏的質量控制方法，本實驗擬通過十批不同產地何首烏指紋圖譜，得出何首烏藥材的指紋圖譜共有模式。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A高效液相色譜儀，SPD-M10Avp二極管陣列檢測器（日本島津），LC Solution 色譜工作站（日本島津）;sartorius電子分析天平。

1.2 試劑與藥材

2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品 （以下簡稱二苯乙烯苷，， 批號： 201005）;大黃素對照品（批號： 110756- 200110）;大黃素甲醚對照品（批號： 110758-200610）均購于中國藥品生物制品檢定所，乙腈為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純。10批不同產地何首烏樣品，詳見表1，經鑒定為蓼科植物何首烏的干燥塊根。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Water X-Terra色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 m）;流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B）;梯度洗脫：0 ～ 5 min，5% A;5 ～10 min，5% A～15% A;10 min ～ 30 min，15% A ～ 30% A;30 min ～ 60 min，30% A ～ 90% A。流速為1 ml/min，柱溫：25 ℃;檢測波長：265 nm。進樣量10 L。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

稱取二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚對照品適量，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度。搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備

取何首烏藥材粉末約0.5 g， 精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇25 ml，稱定重量，超聲提取30 min，取出，放涼，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，過0.45 m微孔濾膜，備用。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗

取同一份供試品溶液，按“2.1”項下條件重復進樣 5 次，測得的指紋圖譜與其所得共有模式圖譜的相關系數均大于0.95，其共有峰的保留時間的 RSD 和峰面積的 RSD 均小于3 %，符合指紋圖譜技術的要求。

2.3.2 重復性試驗

精密稱取 6 份同一批藥材粉末，按“2.2.2”項的方法平行制得 6 份供試品溶液，同法進行檢測。6 份供試品溶液所測色譜指紋圖譜與其所得共有模式圖譜的均值相關系數（中位數）均大于 0.95，其共有峰的保留時間的RSD和峰面積的RSD均小于3 %，符合指紋圖譜的技術要求。

2.3.3 穩定性試驗

取同一份供試品溶液，按“2.1”項下條件于 0，3，6，9，18，24 h 進樣檢測，測得的指紋圖譜與其所得共有模式圖譜的相關系數均大于 0.95，各色譜峰峰面積RSD和保留時間RSD 均小于3 %，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.4 樣品測定

分別吸取上述供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖。采用MATLA相似度評價軟件對各樣品色譜圖的原始數據文件進行分析，以10批樣品生成的對照圖譜（中位數法）作為對照模版，計算各色譜圖的整體相似度，結果見表2。從表可以看出各批何首烏藥材質量相對穩定。

2.5 指紋圖譜的建立和辨認

對樣品的供試品溶液進行HPLC-DAD檢測，得到不同批次何首烏HPLC指紋圖譜（見圖1），對何首烏HPLC色譜圖進行共有峰識別，確定有13個共有峰（見圖2），構建了何首烏藥材的HPLC色譜圖的指紋特征，作為何首烏鑒別的依據，其中4號峰為二苯乙烯苷，11號峰為大黃素，13號峰為大黃素甲醚，以二苯乙烯苷為對照，得出13個共有峰相對保留時間重現性較好，RSD為0.03 %～1.0 %;相對峰面積差異較大，其RSD為38.22 %～99.82 %。表明不同產地何首烏藥材其組成成分基本上一致，但各峰的峰面積有差異，表明各成分含量存在差異。

3 討論

3.1 提取溶劑的考察

分別用95 %乙醇、75 %乙醇、50 %乙醇、95 %甲醇、75 %甲醇、50 %甲醇6種溶劑各25 mL提取，結果表明95 %甲醇提取出峰最多，指示95 %的甲醇提取出的何首烏化學成分更全面。

3.2 提取方法的考察

分別采用了加熱回流30 min提取、加熱回流1 h提取、超聲30 min提取、超聲45 min提取。結果顯示同一提取方法提取時間不同差別不大，其中超聲提取比加熱回流提取效果要好。所以選擇30 min超聲提取作為提取方法。

3.3 流動相的選擇

甲醇-水，甲醇-0.1 %磷酸，乙腈-0.1 %磷酸等不同流動相組合考察結果顯示，以乙腈-0.1 %磷酸為流動相，能較好地使樣品中各色譜峰分離，且峰性對稱。故選乙腈-0.1 %磷酸作為流動相系統。

3.4 檢測波長的選擇

對供試品溶液進行200 ～ 800 nm全波長掃描，其最佳吸收波長為265 nm，能給出最全、最佳的出峰信息，確定其為方法學考察波長。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：175- 177

[2] Yang PY，Almofti MR，Lu L，et a1.Reduction of atherosclerosis in cholesterol-fed rabbits and decrease of expressions of intracellular adhesion molecule-1 and vascular endothelial growth factor in foam cells by a water-soluble fraction of Polygonum muhiflorum [J].J Pharrnacol Sci，2005， 99 （3）：294-300.

[3] Xiao PG，Xing ST，Wang LW.Immunological aspects of Chinese medicinal plants as antiageing drugs [J].J Ethnopharmacol，1993，38（2-3）：167-175.

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