基于Wnt／β-catenin信號通路探討陽和湯對兔膝骨關節炎的影響

黃澤靈 ，何俊君 ，施珊妮 ，洪振強 ，2*

（1.福建中醫藥大學中醫學院，福建 福州 350122；2.中醫骨傷及運動康復教育部重點實驗室，福建 福州 350122）

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是最常見的關節退行性疾病，臨床表現以緩慢性關節疼痛、腫大、僵硬伴關節功能障礙為主。OA除了軟骨的損傷和退變外，還與滑膜炎癥、關節骨重塑、骨贅形成以及關節周圍肌力減弱等有關［1］。上述病變由不同分子組成的復雜信號網絡來調節，其中包括Wnt／β-catenin信號通路，該通路在OA中被激活，可以調節關節軟骨的成熟、軟骨外基質分解代謝等，對Wnt／βcatenin通路的調控成為OA的治療靶標［2］。近年來，陽和湯在治療膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）的臨床運用中取得了良好療效［3-5］，研究表明陽和湯能抑制軟骨細胞凋亡，減少軟骨外基質破壞，減少炎癥因子表達，從而延緩OA進展［6-8］，但具體機制仍未明確。本研究通過關節腔注射木瓜蛋白酶建立兔KOA模型，并予陽和湯干預，觀察其對炎癥反應、Wnt／β-catenin信號通路及軟骨組織的影響，探討陽和湯防治OA的作用機制，為臨床使用陽和湯治療KOA提供理論依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 4～6月齡健康新西蘭大白兔24只，體質量2.0～2.5 kg，雌雄各半，購于上海市松江區松聯實驗動物場，實驗動物生產許可證號SCXK（滬）2017-0008。委托福建中醫藥大學實驗動物中心［SYXK（閩）2014-0006］代購并飼養。

1.2 實驗藥物 陽和湯藥物組成：熟地黃30 g，肉桂 3 g，麻黃 2 g，鹿角膠 9 g，白芥子 6 g，姜炭 2 g，生甘草3 g，購于福建中醫藥大學附屬第三人民醫院；西樂葆（輝瑞制藥有限公司）。

1.3 主要試劑及儀器 木瓜蛋白酶（美國Sigma公司）；HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；即用型免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術開發有限 公 司 ）；Rabbit Anti-Wnt4 antibody、Rabbit Antiβ-catenin antibody（Proteintech Group）；DAB 顯色試劑盒（博士德生物工程有限公司）；ELISA檢測試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）。自動脫水機、石蠟包埋機（孝感亞光醫用電子技術有限公司）；石蠟切片機、光鏡（德國徠卡公司）。

2 實驗方法

2.1 動物分組 將24只4～6月齡健康新西蘭兔隨機分為空白組、模型組、西樂葆組和陽和湯組，每組6只。

2.2 模型建立 空白組予常規飼養，不予造模；其余3組分別在實驗開始的第1、4、7天采用關節腔內注射木瓜蛋白酶進行造模［9-11］，動物麻醉后，膝關節周圍備皮消毒，注射0.1 mL木瓜蛋白酶溶液至關節腔，注射后用棉球壓住針眼并再次屈伸膝關節使木瓜蛋白酶溶液充分浸潤至整個關節腔內。每日強迫動物于空地上活動30 min，分2次進行，連續驅趕4周后可獲得OA模型。模型鑒定：進行膝關節Lequesne MG評分［12］，總分≥4分表示造模成功，可納入進行藥物干預。

2.3 藥物干預 按成人體表面積與家兔體表面積換算［13］，陽和湯組按 6 g／（kg·d）予陽和湯灌胃，西樂葆組按 24 mg／（kg·d）予西樂葆灌胃，空白組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續給藥2周。

2.4 標本的采集與制備 停藥1周后采集標本，標本采集前各組動物禁食不禁水。腹腔注射10%水合氯醛溶液（3 mL／kg）麻醉動物。行髕骨上緣橫向切口，逐層分離至關節囊，屈曲并輕輕擠壓膝關節內外側，用注射器抽取集中在脛骨平臺的關節液存入EP管中，迅速投入液氮中保存。取雙膝關節股骨髁，清除周邊結締組織，用4%多聚甲醛固定，常規脫鈣、包埋和切片。

2.5 檢測指標及方法 測量4組干預前后膝關節局部皮溫、周徑；Lequesne MG評分評估藥物干預前后膝關節功能；ELISA法檢測關節液中 IL-1β、TNF-α、MMP-13含量；光鏡下觀察關節軟骨病理改變和進行Mankin's評分［14］；免疫組化檢測軟骨組織Wnt4、β-catenin表達情況及陽性表達區域積分光密度（IOD）。

2.6 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析。計量資料以表示，符合正態分布采用單因素方差分析，若方差齊，采用LSD法進行各組間兩兩比較；若方差不齊，則采用Games-Howell法進行兩兩比較。非正態分布數據組間比較采用多樣本秩和檢驗進行兩兩比較。

3 結 果

3.1 4組局部皮溫、膝關節周徑、Lequesne MG評分比較 見表1。

表1 4組局部皮溫、膝關節周徑、Lequesne MG評分比較

表1 4組局部皮溫、膝關節周徑、Lequesne MG評分比較

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

組別空白組模型組西樂葆組陽和湯組n 6 6 6 6局部皮溫／℃36.017±0.172 38.003±0.7691）37.500±0.5021）37.317±0.8891）關節周徑／cm 9.917±0.842 12.500±0.5141）11.250±0.3992）11.400±0.3101）2）Lequense MG評分／分0.000±0.000 5.167±0.4081）2.500±1.5171）2）3.000±0.6321）2）

3.2 軟骨組織HE染色 空白組軟骨表層光滑、平整，軟骨細胞分布均勻，序列整齊，層次清晰，軟骨細胞無簇集，潮線完整；模型組軟骨表面破損嚴重，基質染色不均，表層軟骨細胞丟失，移形層軟骨細胞簇集，輻射層、鈣化層軟骨細胞數量明顯減少、排列紊亂；陽和湯組軟骨表層較光滑，軟骨細胞增多，排列較規則，局部細胞集簇，基質染色尚均勻，潮線完整；西樂葆組軟骨表層不平整，可見小缺損，軟骨細胞增多，排列尚規則，少量細胞集簇，染色尚均勻，潮線完整，見圖1。

3.3 4組關節軟骨病理切片Mankin's評分結果見表2。

表2 4組關節軟骨病理切片Mankin's評分比較

表2 4組關節軟骨病理切片Mankin's評分比較

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

組別空白組模型組西樂葆組陽和湯組n 6 6 6 6 Mankin's評分0.3±0.51 5.3±1.211）3.0±0.891）2）3.1±1.161）2）

3.4 4組關節軟骨中Wnt4、β-catenin的含量比較見表3。

表3 4組軟骨組織Wnt4、β-catenin免疫組化 IOD 比較

表3 4組軟骨組織Wnt4、β-catenin免疫組化 IOD 比較

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

組別空白組模型組西樂葆組陽和湯組n 6 6 6 6 Wnt4 622.939±162.435 26079.237±2818.9881）3188.485±530.8651）2）3270.973±866.6761）2）β-catenin 1006.996±119.740 22149.471±4714.0921）3844.582±447.7331）2）3792.487±1213.2651）2）

3.5 4組關節液中 IL-1β、TNF-α、MMP-13 含量比較 見表4。

4 討 論

OA屬中醫“痹證”“骨痹”“膝痹”等范疇，陽虛寒凝型是其常見類型［15-17］，其主要病機為稟賦不足或素體陽虛，筋脈失于溫煦，寒從中生，或復感風寒濕邪致四肢冷感，遇寒痛增。寒性收引，筋脈收縮攣急，故肢體屈伸不利，若寒邪夾濕，阻滯經絡關節，陽氣不得布達，則見關節酸痛重著［18］。陽和湯源自清代王洪緒《外科證治全生集》，主治陽虛寒凝證，若痹證日久，外邪蟄伏于筋骨之間，祛邪困難，此時單純以溫里散寒則邪無出路，單純以開表宣痹則里寒不除，表里不通，經絡阻隔，難以取效。陽和湯既用肉桂、炮姜溫里散寒，破陰扶陽以溫里；又用麻黃辛溫發散，開達腠理，宣散寒邪以疏表；再用白芥子散寒祛濕，利氣通滯，以通達表里，是臨床上攻補兼備、剛柔相濟之治痹良方，臨床研究證明陽和湯治療 KOA 療效良好［3-5］。

表 4 4 組關節液中 IL-1β、TNF-α、MMP-13 含量比較

表 4 4 組關節液中 IL-1β、TNF-α、MMP-13 含量比較

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

組別空白組模型組西樂葆組陽和湯組n 6 6 6 6 IL-1β 11.614±7.004 45.523±31.4891）16.439±10.9371）2）12.932±3.0041）2）TNF-α 164.865±66.339 300.382±27.9931）171.315±39.6661）2）176.641±7.7691）2）MMP-13 125.867±28.266 393.252±110.9891）206.359±65.7881）2）198.437±37.6881）2）

關節軟骨的損傷退變及炎癥反應是骨關節炎進展的重要因素，許多研究表明Wnt信號通路可能與OA進展和嚴重程度相關。Wnt是脊椎動物中的分泌型糖蛋白［19］，可以激活不同的級聯信號，其中β-catenin是Wnt信號通路的經典途徑，該途徑的失調被認為是癌癥、慢性炎癥和退行性疾病發病機理的核心［2］。Wnt蛋白可以與Wnt受體復合物結合，該受體復合物由卷曲受體（FZD）和共激活因子脂蛋白相關蛋白受體5或6（LRP5／6）組成。在Wnt與其受體相互作用后，將帶有β-catenin的多蛋白復合物束縛向細胞膜，從而保護β-catenin免于降解，隨后β-catenin在細胞中積累并易位至細胞核，與轉錄因子 ／淋巴增強結合因子（TCF／Lef）結合，激活 βcatenin 的轉錄活性［20］。 過表達的 Wnt／β-catenin 一方面通過抑制軟骨細胞的增殖及Ⅱ型膠原蛋白的分泌導致軟骨退化，一方面導致滑膜成纖維細胞過度增殖和Ⅰ型膠原沉積引起滑膜炎癥的發生發展［21］。本實驗結果顯示，模型組軟骨組織中Wnt4和β-catenin高表達，經過治療后二者表達量明顯下降、炎癥反應及軟骨退變程度明顯改善，提示陽和湯對兔KOA的防治作用可能與Wnt／β-catenin通路被抑制有關。

研究表明，OA關節組織和滑液中均存在促炎細胞因子，如白細胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等［22］。 IL-1β 是參與軟骨破壞的主要促炎細胞因子，在原代培養的關節軟骨細胞中誘導Wnt-5a和Wnt-7a的表達，Wnt表達也刺激了軟骨細胞中 β-catenin 的水平升高［23］；而 TNF-α 能誘導滑膜組織中β-catenin、MMP-7等因子的分泌，從而促進滑膜炎癥的進一步發展［24］。由此說明IL-1β和TNF-α可能通過Wnt／β-catenin通路驅動OA炎癥反應和誘導軟骨退變。基質金屬蛋白酶（MMPs）在軟骨退化中起著重要的作用，在OA患者的關節軟骨細胞中發現MMP-1、MMP-9和MMP-13的mRNA高表達，其中MMP-13與OA密切相關，其表達量隨著骨性關節炎的進展而逐漸增加，且MMP-13是 Wnt／β-catenin 信號通路的下游因子［25］，受該通路的調控。IL-1β和TNF-α對軟骨中MMPs的表達還有直接的誘導作用，既能刺激MMPs在軟骨降解中發揮作用，還能阻斷新細胞外基質成分的合成［26］。

本實驗中各組皮溫、膝關節周徑、Lequesne MG評分結果顯示，陽和湯組兔子膝關節顯示出較輕的炎癥表現；軟骨組織光鏡觀察及Mankin's評分顯示陽和湯對OA軟骨組織具有保護作用。課題組前期研究和本次實驗室指標檢測結果表明陽和湯防治OA的作用部分可能是通過降低炎癥因子TNF-α和 IL-1β 的表達，抑制 Wnt／β-catenin信號通路，改善MMP-13對軟骨退變的影響來實現的，但其具體機制有待于更深入的實驗研究。