重度子癇前期人胎盤絨毛膜板動(dòng)脈中鈣激活氯離子通道的表達(dá)情況

蘭秋麗，傅曉冬

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 產(chǎn)科(瀘州 646000)

妊娠期高血壓疾病(hypertensive disorder complicating pregnancy,HDCP)是一類妊娠與血壓升高并存且嚴(yán)重影響母兒健康的疾病,可造成多器官和系統(tǒng)損害，導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局。鈣激活氯離子通道(Calcium-activated chloride channels,CaCCs)是一類分布于細(xì)胞膜，由細(xì)胞內(nèi)鈣離子激活而轉(zhuǎn)運(yùn)陰離子的離子通道，2008年研究[1]揭示，跨膜蛋白16A(transmembrane protein 16A，TMEM16A)乃該通道分子基礎(chǔ),有研究[2-3]發(fā)現(xiàn)，多部位的動(dòng)脈平滑肌、血管內(nèi)皮細(xì)胞中均有表達(dá)，在調(diào)節(jié)血管收縮和血管張力中具有重要作用。本研究通過比較TMEM16A在正常妊娠與重度子癇前期不同類型患者的胎盤絨毛膜板動(dòng)脈中的表達(dá)差異情況，探究該通道與妊娠期高血壓疾病之間的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018年11月至2019年6月于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科分娩的50例孕婦作為研究對(duì)象。其中正常孕婦20例作為對(duì)照組(normal control，NC)，重度子癇前期20例作為重度孕癇前期組(severe preeclampsia,SPE)；早發(fā)型重度子癇前期(early-onsetsevere preeclampsia,ESPE)及晚發(fā)型重度子癇前期(late-onset severe preeclampsia,LSPE)各15例成組進(jìn)行比較；重度子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn)參考人民衛(wèi)生出版社第九版婦產(chǎn)科學(xué)[6]，其中發(fā)病孕周<34周診斷為早發(fā)型重度子癇前期，>34周診斷為晚發(fā)型重度子癇前期，均不伴胎兒生長(zhǎng)受限。納入標(biāo)準(zhǔn)：22～45歲育齡期婦女；單胎妊娠；根據(jù)早孕超聲核實(shí)孕周，孕周準(zhǔn)確。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠期糖尿病、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積、妊娠合并心臟病等妊娠相關(guān)疾病。本研究獲西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理審批，標(biāo)本取材前與患者及家屬溝通并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集 按上述標(biāo)準(zhǔn)選取的研究對(duì)象，無論經(jīng)陰道分娩或剖宮產(chǎn)分娩，無論自然臨產(chǎn)抑或病情需要終止妊娠，在胎盤娩出后盡快辨認(rèn)胎盤膜板動(dòng)脈分支，銳性取下標(biāo)本放入標(biāo)本箱中立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，在冰上鈍銳性分離膜板動(dòng)脈表面系膜及其他組織，在無菌水中漂洗干凈后放入無菌EP管中，做好標(biāo)記放入-80 ℃冰箱。

1.2.2 主要試劑、儀器及耗材 總RNA提取試劑盒，QuantiNova SYBR Green PCR Kit，2×Taq PCR MasterMix(TIANGEN, China)，Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix，TMEM16A及β-actin基因上下游引物由上海Sangon Biotech合成，RIPA 裂解液，BCA蛋白定量試劑盒,蛋白酶抑制劑PMSF，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)；β-actinmonoclonal antibody,Recombinnant Anti-TMEM16A antibody(SP31)，Goat anti-Rabbit Secondary Antibody。核酸濃度檢測(cè)儀，凝膠成像系統(tǒng)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，蛋白電泳-轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，一體式化學(xué)發(fā)光成像儀。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR主要步驟 在液氮的低溫維持下將標(biāo)本研磨成粉末狀，取80 mg與裂解液1 mL分裝在無菌EP管中充分裂解，然后按分離、沉淀、洗滌、溶解的步驟提取RNA,并加入配置好的瓊脂糖凝膠后電泳，再用凝膠成像系統(tǒng)成像觀察其完整度；完整度較好的通過RNA光譜分析系統(tǒng)測(cè)定濃度，據(jù)濃度將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,選取β-actin作為內(nèi)參基因，通過QPCR系統(tǒng)測(cè)定目的基因TMEM16A mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)主要步驟 在液氮的低溫維持下將標(biāo)本研磨成粉末，取100 mg與RIPA蛋白裂解液(含蛋白酶抑制劑PMSF)1 mL分裝在無菌EP管中充分裂解，再用超聲破碎儀裂解細(xì)胞，取上清液加蛋白上樣緩沖液，加熱使蛋白變性后置于-20 ℃低溫中保存，經(jīng)過配膠、加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜(內(nèi)參的分子量為43 kDa,TMEM16A的分子量為114 kDa)、封閉、過夜孵育一抗(內(nèi)參一抗稀釋比例為1∶2 000，TMEM16A一抗稀釋比例為1∶2 000)，PBST洗膜后孵育二抗2 h(內(nèi)參一抗稀釋比例為1∶5 000， TMEM16A一抗稀釋比例為1∶5 000)，洗膜后置加發(fā)光液，于成像儀中成像后測(cè)定灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較

NC組與SPE組血壓比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；分娩孕周、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；ESPE組與LSPE組分娩孕周比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；年齡、血壓比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1～2)。

表1 NC組、SPE組的基本資料比較

表2 ESPE組、LSPE組的基本資料的比較

2.2 NC、SPE組及ESPE、LSPE組中TMEM16A mRNA的相對(duì)定量水平比較

NC組△CT值水平為(15.15±0.81)，SPE組△CT值水平為(13.86±0.54)，2-ΔΔCt值水平為(2.50±0.50)，SPE組胎盤模板動(dòng)脈上TMEM16A mRNA的表達(dá)水平是正常組的(2.50±0.50)倍，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義(P<0.05)，即ESPE組△CT值水平為(14.11±0.70)，2-ΔΔCt值水平為(2.22±0.41)，LSPE組△CT值水平為(12.99±0.46)，LSPE組TMEM16A mRNA的表達(dá)水平是ESPE組的(2.22±0.41)倍，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3～4)。

類別ΔCt值2-ΔΔCt 值NC組15.15±0.81-SPE組13.86±0.542.50±0.50t5.939P<0.001

類別ΔCt值2-ΔΔCt 值ESPE組14.11±0.70-LSPE組12.99±0.462.22±0.41t5.218P<0.001

2.3 NC、SPE組及ESPE、LSPE組中TMEM16A蛋白的表達(dá)情況

NC組和SPE組灰度值比值經(jīng)Levene′s方差齊性檢驗(yàn)提示方差不齊，采用兩獨(dú)立樣本的t′檢驗(yàn)進(jìn)行分析，在NC組中TMEM16A的蛋白灰度值比值為(0.28±0.07)，在SPE組中的蛋白灰度值比值為(0.62±0.25)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t′=-4.186，P=0.002)；ESPE組和LSPE組灰度值比值經(jīng)Levene′s方差齊性檢驗(yàn)提示方差齊，采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，在ESPE組中蛋白灰度值比值為(0.47±0.18)，在LSPE組中蛋白灰度值比值(0.75±0.29)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.524，P=0.021)(圖1)。

3 討論

HDCP是一種多因素、多通路及多機(jī)制誘發(fā)的疾病，在全身小血管痙攣和血管內(nèi)皮損傷的基礎(chǔ)上出現(xiàn)全身多器官和系統(tǒng)損害[4-6]，病情多復(fù)雜、變化快，多可導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局，目前針對(duì)發(fā)病機(jī)制的研究中“兩階段”學(xué)說被大部分學(xué)者認(rèn)同[5]，包括子宮螺旋動(dòng)脈滋養(yǎng)細(xì)胞重鑄不足，胎盤淺著床導(dǎo)致缺血、缺氧，釋放胎盤因子；胎盤因子進(jìn)入母體血液循環(huán)，促使炎癥免疫過度激活及血管內(nèi)皮損傷兩個(gè)階段，誘發(fā)血管痙攣、血壓升高等高血壓的一系列變化。胎盤血管不受神經(jīng)支配[7]，其血管緊張度的調(diào)節(jié)受血液供應(yīng)所帶離子或分子的控制[8]，在血管的平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上作用的離子通道是細(xì)胞內(nèi)外離子交換保持穩(wěn)態(tài)的重要通道，若表達(dá)和功能發(fā)生異常會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外離子失衡，同時(shí)引起血管張力紊亂，成為各種血管性疾病的病理性生理基礎(chǔ)，盡管妊娠期高血壓疾病與高血壓發(fā)病機(jī)制不盡相同，但HDCP仍屬血管性疾病，故在對(duì)HDCP發(fā)病機(jī)制的研究中，對(duì)通道的研究較廣泛，其中主要包括鉀通道、氯離子通道、水通道及瞬時(shí)受體電位通道[9]，目前鉀通道研究最多、最全面的通道，而氯離子通道與HDCP的相關(guān)研究極少，有研究[10]提示，在心血管系統(tǒng)中主動(dòng)脈至毛細(xì)血管均有TMEM16A表達(dá)，其在血壓和外周阻力的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。近年TMEM16A在女性生殖系統(tǒng)中的分布和作用的逐漸被揭示[11-13]，如參與子宮平滑肌的收縮、婦科腫瘤的發(fā)生、卵巢激素的產(chǎn)生、受精著床等過程，通過對(duì)該通道的研究拓展對(duì)相關(guān)疾病認(rèn)知及治療具有一定價(jià)值，如通過TMEM16A在正常妊娠及HDCP不同類型中的表達(dá)情況探究?jī)烧叩南嚓P(guān)性，為HDCP發(fā)病機(jī)制的完善奠定理論基礎(chǔ)。

氯離子是人體內(nèi)主要陰離子，而介導(dǎo)氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)的氯離子通道廣泛存在于人體內(nèi)，血管平滑肌上主要有鈣激活氯離子通道、容量敏感性氯離子通道和鈣依賴性氯離子通道3類氯離子通道，近年鈣激活氯離子通道在調(diào)控血管收縮方面作用逐漸被揭示，成為藥物精準(zhǔn)靶向治療肺動(dòng)脈高壓、高血壓、腫瘤等相關(guān)疾病的研究熱點(diǎn)，CaCCs受電壓和鈣離子濃度雙重調(diào)節(jié)[14]，表現(xiàn)為若細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度升高則可誘發(fā)通道開放，研究[15]證實(shí)，HDCP患者血漿鈣離子濃度減低，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯升高，由此可推測(cè)，在HDCP患者的血管平滑肌上該特點(diǎn)可誘發(fā)鈣激活氯離子通道充分開放產(chǎn)生瞬時(shí)的內(nèi)向電流，導(dǎo)致平滑細(xì)胞節(jié)律性收縮增強(qiáng)，參與外周阻力及血壓的調(diào)節(jié)。研究[16]表明，TMEM16A 通道會(huì)產(chǎn)生Cl--Ca2+電流，且激活會(huì)導(dǎo)致血管和非血管平滑肌中的膜去極化和收縮。自TMEM16A被確認(rèn)為CaCCs的基礎(chǔ)分子以來，有研究[17]證實(shí)，TMEM16A在高血壓模型中顯著上調(diào)，2015年唐巧云[18]提出，TMEM16A具有雙重作用 ，既是高血壓發(fā)生的致病機(jī)制，又具有保護(hù)因子的作用，如在原發(fā)性高血壓中TMEM16A與血壓呈正相關(guān)，而在腎性高血壓中則相反[19]。研究[18]表明，TMEM16A的上調(diào)可促進(jìn)基底細(xì)胞增殖，過度表達(dá)則抑制細(xì)胞增殖，起保護(hù)作用，在TMEM16A的缺如情況下，血管對(duì)促收縮介質(zhì)不敏感。但仍有研究[20]結(jié)果與此相反，認(rèn)為高血壓的腸系膜動(dòng)脈中TMEM16A的表達(dá)下調(diào)，并表示與中山大學(xué)在第九屆全國(guó)心血管藥理學(xué)術(shù)會(huì)議中的一項(xiàng)研究[21]相同，即TMEM16A可能是通過下調(diào)表達(dá)來限制血壓繼續(xù)升高來發(fā)揮保護(hù)作用，也可能是長(zhǎng)期高血壓狀態(tài)下發(fā)生了結(jié)構(gòu)變化。趙美平等[22]研究中還提出，低氧或缺氧狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致TMEM16A高表達(dá)而促進(jìn)血管平滑肌的增殖和重建，而血管平滑肌的增殖會(huì)造成血管收縮增加，與HDCP胎盤缺血缺氧的理論相似，由此推測(cè)TMEM16A可能參與HDCP的發(fā)生發(fā)展。

20世紀(jì)80年代由于早發(fā)型子癇前期對(duì)母嬰健康的嚴(yán)重影響，引起歐美圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)界高度重視，診斷以HDCP的發(fā)病孕周為主，但臨床表現(xiàn)及危害程度與晚發(fā)型的差異大，因此有學(xué)者推測(cè)早發(fā)型及晚發(fā)型子癇前期可能是HDCP的兩種亞型。早發(fā)型性子癇前期臨床表現(xiàn)為“胎盤源性”疾病特點(diǎn)，即母體及胎兒雙方致病，甚至可導(dǎo)致妊娠終止后母嬰的遠(yuǎn)期不良預(yù)后，而晚發(fā)型則表現(xiàn)為“母源性”疾病特點(diǎn)，以對(duì)母體的影響為主，對(duì)胎兒危害相對(duì)較小。本研究結(jié)果表明，HDCP患者的胎盤膜板動(dòng)脈中TMEM16A的表達(dá)明顯高于正常組，但在重度子癇前期中晚發(fā)型明顯高于早發(fā)型，與預(yù)想趨勢(shì)相悖，結(jié)合唐巧云[18]、郭書紅[20]及張政等[21]的研究中提出的TMEM16A在血壓調(diào)控中可能具有雙重作用，可通過下調(diào)來限制血管過分收縮，起保護(hù)因子的作用，由此推測(cè)，TMEM16A可能因受到負(fù)反饋調(diào)節(jié)以同樣機(jī)制在早發(fā)型子癇前期患者中起保護(hù)作用，抑或高濃度鈣離子的過度刺激導(dǎo)致TMEM16A發(fā)生了結(jié)構(gòu)或功能的變化等。目前TMEM16A參與血管性疾病發(fā)病機(jī)制研究尚不全面，范圍局限在動(dòng)物模型或局部探索的基礎(chǔ)上，仍有許多問題待解決，如若該通道具有雙重作用，那么過度表達(dá)的范圍如何界定，激發(fā)TMEM16A成為保護(hù)因子的條件等均需進(jìn)一步研究。

綜上所述，TMEM16A在重度子癇前期組中的表達(dá)明顯上調(diào)，但重度子癇前期晚發(fā)型表達(dá)高于早發(fā)型，表明此通道與HDCP具有相關(guān)性，但其參與HDCP發(fā)生的機(jī)制尚不清楚，需進(jìn)一步探究，如通過干預(yù)HDCP高風(fēng)險(xiǎn)患者TMEM16A的表達(dá)可否改變疾病的發(fā)展方向，臍帶血管的表達(dá)情況與妊娠結(jié)局的關(guān)系；可通過血管環(huán)、妊娠高血壓模型等進(jìn)一步研究?jī)烧叩囊蚬P(guān)系，明確鈣激活氯離子通道參與HDCP的機(jī)制，為完善HDCP發(fā)病機(jī)制學(xué)說及藥物靶向治療提供新的途徑。