不同成份脫鈣液對骨組織脫鈣效果的比較*

祁宏枝，羅添友，唐 濤

1. 成都中醫藥大學附屬四川省八一康復中心 病理科(成都 611135)；2.四川大學華西醫院 病理科(成都 610041)；3. 成都中醫藥大學附屬四川省八一康復中心 骨科(成都 611135)

骨組織由細胞、基質和纖維成份構成，其中基質含有大量的固體無機鹽，主要成份為羥基磷灰石結晶，所以骨組織質地較硬，在病理技術中難以制成切片，從而影響臨床診斷，因此在病理切片前必須對其脫鈣處理[1]。目前病理科常用的脫鈣液是復合酸類脫鈣液，是將不同種類酸類按比例與中性福爾馬林液配伍使用，從而將骨組織中難溶于水的碳酸鈣和磷酸鈣轉化為易溶于水的鈣鹽和磷酸鹽等，達到軟化和固定標本的目的[2-3]。目前臨床上配制的脫鈣液種類繁多，在軟化和固定標本時均有各自的優缺點。本研究擬比較3種不同成份的脫鈣液對股骨頭組織進行脫鈣固定的效果，為臨床病理技術提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2018年5—10月在四川省八一康復中心手術室送檢的股骨頭標本20例為研究對象。

1.2 儀器

RF-2A電動組織取材刀購自西安瑞豐儀器設備有限責任公司，ES全自動脫水機、石蠟包埋機、ME+全自動石蠟切片機、全自動染色機及全自動膠片封片機均購自美國珊頓賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 試劑

蘇木精購自上海國藥集團化學試劑有限公司、無水乙醇購自成都金山化學試劑有限公司；硫酸鋁鉀、碘酸鈉均購自成都市聯合化工試劑研究所；醇溶性伊紅購自成都市科龍化工試劑廠；10%中性福爾馬林、濃鹽酸及硝酸均購自成都市科隆化學品有限公司；免疫組化試劑：一抗S-100、CD68、Ki-67、二抗、DAB顯色液均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；檸檬酸抗原修復液、PBS液均購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.4 試劑配制

1.4.1 Gill蘇木精改良配置 Ⅰ液：蘇木精1 g溶于50 mL無水乙醇；Ⅱ液：硫酸鋁鉀4 g完全溶于150 mL蒸餾水；Ⅰ、Ⅱ混合后，加入100 mg碘酸鈉，最后加入3 mL冰乙酸。

1.4.2 脫鈣液配制 1)甲液：硝酸10 mL加入10%中性福爾馬林90 mL，配制成10%硝酸甲醛液；2)乙液：鹽酸30 mL加入10%中性福爾馬林70 mL，配制成30%鹽酸甲醛液；3)丙液：鹽酸30 mL+甲酸30 mL加入10%中性福爾馬林40 mL，配制成30%鹽酸甲酸甲醛液。

1.5 方法

1.5.1 脫鈣方法 首先將新鮮離體股骨頭組織用10%中性福爾馬林及時固定24 h，每例股骨頭分別取9塊，制成大小約1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm標本，每個標本分別做好標記。所有骨組織均分成3份，每份3塊，3份骨組織成分大致相當，分別放入甲、乙、丙3種新鮮脫鈣液中(每瓶脫鈣液為100～200 mL)，在室溫下進行脫鈣并記錄脫鈣時間。

1.5.2 脫鈣后標本處理 標本檢查以手感有彈性、用大頭針能輕松刺入為脫鈣良好，所有標本脫鈣后均放人自來水中反復沖洗30 min，再放入全自動脫水機中進一步脫水處理，次日進行石蠟包埋，切片厚度為2～4 μm，行常規HE染色，全自動封片機封片后鏡下觀察。

1.5.3 免疫組化染色 進行常規免疫組化染色：采用Envision法染色， 選取9例C組股骨頭組織切片，70 ℃烤片40 min(防脫載玻片)，脫蠟后放入3%H2O2處理15 min，pH 6.0的檸檬酸抗原修復液高壓鍋修復3 min。再隨機分成3份，分別滴加一抗S-100、CD68和Ki67，4～8 ℃過夜，PBS液沖洗2次，滴加二抗，37 ℃孵育60 min， DAB顯色，蘇木精復染細胞核，脫水、透明、封片、觀察、拍照。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 3組骨組織脫鈣時間比較

3組骨組織脫鈣時間比較，差異有統計學意義(F=281.577,P<0.05)。與甲組比較，乙組和丙組脫鈣時間明顯縮短(P<0.05)，且丙組脫鈣時間比乙組短(P<0.05)(表1)。

表1 3種脫鈣液脫鈣時間的比較

注：與甲組比較，*P<0.05；與乙組比較，#P<0.05

2.2 3組骨組織的酸化程度比較

根據骨組織表面顏色判斷其酸化程度。股骨頭組織經3種脫鈣液浸泡24 h后，骨組織的表面呈臘黃色，每組出現臘黃色的時間依次為丙組<乙組<甲組，且浸泡時間越長，發黃現象越明顯。

2.3 3組骨組織的切片效果比較

經3種脫鈣液脫鈣后所有股骨頭組織均能完整切片，但經甲液酸化后的骨組織切片質量較差，沙粒掉落現象明顯，肉眼能看見明顯的切片痕跡；經乙液酸化后的骨組織切片質量較好，偶有沙粒存在，在低倍顯微鏡下能看見明顯的切片痕跡；經丙液酸化后的骨組織切片質量佳，切片時組織松軟，無沙粒感，在低倍顯微鏡下未看見切片痕跡。

2.4 骨組織HE染色效果比較

經甲液和乙液酸化脫鈣后，鏡下可見明顯的切片痕跡，密質骨區域切片不連續，厚薄分布不均。經甲液脫鈣、切片和HE染色后，細胞核染色不均勻，部分核結構不清，染色不均一，局部顏色深，染色質部分模糊不清；經乙液處理后通過HE染色，染色質結構較清晰，核呈紫藍色，核質對比度明顯；經丙液處理后通過HE染色，股骨頭骨組織鏡下結構平整，骨板清晰可見，細胞核呈紫藍色，與細胞質對比鮮明(圖1)。

2.5 股骨頭組織經C液處理后免疫組化染色分析

經丙脫鈣液處理后，S-100、CD68、Ki67在骨髓中的表達清楚可見，經S-100染色后，髓腔中脂肪細胞陽性，脂肪細胞邊緣存在非特異性染色，中間散布實心結構，聚集成圓形的束狀，其中分布數個細胞核；經CD68染色后 髓腔中組織細胞顯示胞漿陽性；經Ki-67染色髓腔中造血細胞灶性陽性(圖2)。

3 討論

本研究參照吳鴻雁等[4]研究并結合臨床病理技術，使用10%硝酸甲醛液作對照，是因為14%～20%的硝酸液對骨組織溶解較明顯，且對脫鈣時間及脫鈣程度不易掌控，因此本研究中選用10%的硝酸甲醛液作對照。

脫鈣是骨組織石蠟切片制備中的重要環節，臨床上常根據鈣鹽溶解度不同采用加酸法將鈣鹽與膠原纖維分離[5-6]，不同的配制液對鈣鹽的溶解系數不同，對鈣鹽的溶解效果和膠原纖維分離程度也不一樣，因此需要優化脫鈣液的配方來達到快速有效的脫鈣，同時對骨組織細胞破壞相對較少的目的。

本研究通過對20例股骨頭組織分別在10%硝酸甲醛液、30%鹽酸甲醛液及30%鹽酸甲酸甲醛液中脫鈣，可以看出，3種脫鈣液都能脫鈣，但從脫鈣時間來比較依次遞減，10%硝酸甲醛液所用時間長達5 d左右才能完成；30%鹽酸甲醛液需要3 d左右，而30%鹽酸甲酸甲醛液所用時間短，一般在24～36 h可達到滿意的脫鈣效果。

從HE染色后切片的質量來看，經30%鹽酸甲酸甲醛液處理切片質量好，股骨頭骨組織鏡下結構平整，骨板清晰，細胞核呈紫藍色，與細胞質對比鮮明；而10%硝酸甲醛脫鈣液處理后切片質量較差，細胞核染色欠均勻，部分細胞核結構不清及染色質模糊。究其原因，10%硝酸甲醛液酸性較弱，溶解鈣鹽能力較差，脫鈣不徹底造成，且硝酸在溶解鈣鹽過程中會產生NO2和CO2氣泡，使局部組織結構會受到破壞，甲酸屬于弱酸，產生CO2氣泡速度較慢，且容易溶解于液體中[7]。10%中性福爾馬林是標本組織常用的固定液，對組織滲透力強、收縮小，能使大多數組織保存較好，加入鹽酸后配制成鹽酸甲醛液，對骨組織固定的同時又能起脫鈣的作用，從而縮短了組織的固定及前期處理時間[8]；在鹽酸甲醛液中加入甲酸后，進一步提升了脫鈣液的酸化能力，脫鈣時間明顯較鹽酸甲醛液縮短，且在HE染色中對細胞核染色結果較好[9]。

另一方面，經30%鹽酸甲酸甲醛液中脫鈣的股骨頭標本，從免疫組化染色效果的效果來看，S-100、CD68及Ki67在骨髓中的表達特異性明顯，經S-100染色后髓腔中脂肪細胞呈陽性，可清楚看見細胞核團；經CD68染色后股骨頭 髓腔中組織細胞顯示胞漿陽性；經Ki67染色骨髓腔中造血細胞灶性陽性，這對股骨頭壞死或骨腫瘤病例的病理診斷提供了可靠的病理技術支持[10]。

綜上所述，30%鹽酸甲酸甲醛液能縮短股骨頭組織的脫鈣時間，增強了HE染色及免疫組化染色的效果。