骨橋蛋白與炎癥分子核因子κB在中耳膽脂瘤上皮組織中的表達及相關(guān)性分析*

唐一萍，馮 俊，馬 鵬

南充市中心醫(yī)院·川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院 耳鼻咽喉頭頸外科(南充 637000)

中耳膽脂瘤為耳鼻喉科的常見病，其病理特征是中耳腔內(nèi)有大量高度角化鱗狀上皮異常增生，并見鄰近組織出現(xiàn)骨質(zhì)破壞。近年隨著臨床對中耳膽脂瘤研究不斷深入，已有研究[1-3]報道，中耳膽脂瘤出現(xiàn)骨質(zhì)破壞的機制為炎癥細胞因子參與骨質(zhì)破壞，破骨細胞有骨溶解作用，酶類介導(dǎo)影響骨質(zhì)吸收作用等。骨橋蛋白(osteoponton,OPN)為分布于細胞外基質(zhì)中的一種分泌型糖基化磷蛋白，相關(guān)文獻[4]報道，OPN可增加骨基質(zhì)與破骨細胞之間的粘附力，使破骨細胞的溶骨活性明顯升高，故其在骨質(zhì)破壞過程中可發(fā)揮重要的作用。炎癥分子核因子κB(NF-κB)為屬于轉(zhuǎn)錄因子的一種，其能夠通過不同途徑促進破骨細胞分化與成熟，進而促使細胞外的骨基質(zhì)發(fā)生降解，引起骨破壞[5]。但在臨床報道中關(guān)于OPN與NF-κB在中耳膽脂瘤上皮組織中的相關(guān)性研究較為少見。鑒于此，本研究通過檢測OPN與NF-κB在中耳膽脂瘤上皮組織中的表達情況以及二者的相關(guān)性，以期為今后臨床診療本病提供一定的指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2017年9月至2019年1月在南充市中心醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科行手術(shù)治療的耳膽脂瘤患者30例為試驗組，其中男16例，女14例，年齡22～65(36.09±4.22)歲；另選取同期30例非膽脂瘤型中耳炎患者為對照組，其中男18例，女12例，年齡20～65(36.71±3.96)歲，兩組年齡、性別等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。手術(shù)過程中取兩組患者適量中耳腔的病變組織作為標(biāo)本。采集的標(biāo)本要求：試驗組標(biāo)本中含有膽脂瘤的上皮組織、皮下結(jié)締組織和囊內(nèi)容物；對照組標(biāo)本為鱗狀上皮組織。

1.2 實驗材料

免疫組化試劑盒(貨號： ZKSP-10447)購自深圳子科生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑(貨號：G1211-1)購自上海生工生物工程有限公司；鼠抗人NF-κB單克隆抗體(貨號：kl824Ga21)、鼠抗人OPN單克隆抗體(貨號：kl899Bo21)均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；雙目生物顯微鏡(型號：LDM500)購自德國Leica徠卡公司。

1.3 方法

兩組標(biāo)本取材后將其置于10%中性福爾馬林溶液中固定，經(jīng)石蠟包埋后，制作成厚度為4 μm的連續(xù)切片。將石蠟切片進行常規(guī)的脫蠟水化，滴加一定量的檸檬酸鹽緩沖液在中、高檔火微波爐中修復(fù)12 min。取出冷卻后，加入適量內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑，靜置10 min后沖洗，并滴加山羊血清，封閉10 min后，甩去血清，滴加一抗(鼠抗人NF-κB單克隆抗體、鼠抗人OPN單克隆抗體)、滴加聚合物增強劑及滴加酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物等操作，并在每孔中注入適量顯色液孵育30 min。然后進行蘇木素復(fù)染、脫水、封片操作，最后在顯微鏡下觀察。與此同時，選擇PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，其余操作與前相同。并以同1張切片上的非染色部位為該張切片陽性處的自身對照。每個標(biāo)本隨機抽選3張切片在光鏡200倍下選4個不同的視野，并在Meta Morph/DPl0/BX41顯微圖像分析儀記錄，以細胞漿、細胞核內(nèi)有棕黃色或深棕黃色顆粒判斷為陽性，以此為標(biāo)準(zhǔn)自動檢測識別所有視野中的陽性結(jié)果，以參數(shù)積分光密度(IOD)表示蛋白顆粒密度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組OPN、NF-κB表達水平比較

試驗組的OPN和NF-κB的陽性表達水平均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(表1)。

表1 兩組OPN、NF-κB表達水平比較

2.2 不同膽脂瘤侵襲程度的OPN、NF-κB表達水平比較

根據(jù)膽脂瘤的破壞范圍以及聽小骨骨質(zhì)破壞情況對其侵襲程度進行分級，其中，Ⅰ級(未見有明顯的聽小骨骨質(zhì)破壞)4例，Ⅱ級(見有砧骨破壞)11例，Ⅲ級(見有砧骨、錘骨破壞)9例，Ⅳ級(見有砧骨、錘骨、乙狀竇溝骨板、乳突天蓋破壞)6例。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，隨膽脂瘤侵襲程度的升高，膽脂瘤上皮組織的OPN、NF-κB陽性表達水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2 不同膽脂瘤侵襲程度的OPN、NF-κB表達水平比較

2.3 相關(guān)性分析

經(jīng)Spearman相關(guān)系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，OPN、NF-κB表達水平與膽脂瘤侵襲程度呈正相關(guān)性(rOPN=0.924，P<0.001；rNF-κB=0.591，P=0.001)，且OPN與NF-κB表達水平呈正相關(guān)(r=0.669，P<0.001)(圖1)。

3 討論

在臨床上，中耳膽脂瘤主要的生物學(xué)特征為聽骨鏈以及其周邊骨質(zhì)受到破壞。若本病患者未能得到及時、有效治療會隨著病情發(fā)展，骨質(zhì)破壞會損及聽骨、面神經(jīng)管、乳突天蓋等而出現(xiàn)面癱、顱內(nèi)感染等嚴重后果。目前，關(guān)于中耳膽脂瘤骨質(zhì)破壞的機制尚無明確的說法，比較趨于一致的觀點[6]認為，膽脂瘤上皮組織及其鄰近組織分泌的細胞因子在中耳膽脂瘤病變發(fā)展過程中起著重要的作用。

3.1 NF-κB與中耳膽脂瘤的關(guān)系

從本質(zhì)上而言，NF-κB屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的一種，起初在B淋巴細胞中被發(fā)現(xiàn)，NF-κB也可表達分布于機體軟骨細胞中。國外也有研究[7]報道，NF-κB能夠通過介導(dǎo)、調(diào)控機體免疫應(yīng)答、炎癥因子釋放、細胞凋亡等病理過程而參與許多炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展。一般情況下，NF-κB是以非活性形式分布于細胞胞漿中，一旦受到外界刺激，病變組織會活化、釋放大量NF-κB，與此同時，該因子還可與免疫球蛋白結(jié)合，進而參與免疫性炎癥的發(fā)展進程及轉(zhuǎn)歸。Jesic等[8]研究顯示，NF-κB能夠參與中耳膽脂瘤的發(fā)生，可能與上調(diào)炎癥介質(zhì)，釋放大量細胞因子有關(guān)。目前，以NF-κB為分子靶點也成為了臨床診治中耳膽脂瘤的新研究方向，尤其是在中耳膽脂瘤治療過程中，應(yīng)用NF-κB活性抑制劑能夠在一定程度上發(fā)揮抑制骨質(zhì)破壞的作用[9]。本研究結(jié)果也顯示，試驗組患者病變上皮組織中NF-κB陽性表達率明顯高于對照組非膽脂瘤型中耳炎患者，而且NF-κB陽性表達率會隨著膽脂瘤侵襲程度加深而增加，表明了NF-κB能夠加劇膽脂瘤病情發(fā)展。

3.2 OPN與中耳膽脂瘤的關(guān)系

OPN是分布于細胞外基質(zhì)的一種功能性蛋白質(zhì)，同時也屬于早期T淋巴細胞活化因子，能夠誘導(dǎo)促炎細胞因子分泌，使骨質(zhì)破壞程度加重[10]。有動物實驗研究[11]發(fā)現(xiàn)，OPN能夠激活多種趨化因子、促炎因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，進而調(diào)控聽小骨骨質(zhì)破壞。此外，OPN還可促進骨質(zhì)發(fā)生病理性鈣化，加快骨質(zhì)變性壞死的進程。在本研究中，試驗組患者的OPN陽性表達率明顯高于對照組，且其陽性表達隨病變侵襲程度增加而升高，表明了OPN在中耳膽脂瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，故其可成為膽脂瘤病變嚴重程度判斷、療效評估、預(yù)后預(yù)測的主要觀察指標(biāo)。

3.3 OPN、NF-κB與中耳膽脂瘤的關(guān)系

當(dāng)前有研究[12]證實，OPN與NF-κB有著密切的相關(guān)性。NF-κB的活化需要以O(shè)PN為基質(zhì)來實現(xiàn)的。體外實驗研究[13]也發(fā)現(xiàn)，在中耳膽脂瘤實驗大鼠中，病變組織的OPN表達水平會隨NF-κB的活性增加而提高，但如果預(yù)先給予大鼠NF-κB活性抑制劑可發(fā)現(xiàn)OPN的表達水平明顯減少，故可猜測中耳膽脂瘤病情進展愈OPN、NF-κB表達程度相關(guān)，而且兩者相互調(diào)控。也有研究[14]認為，中耳膽脂瘤病灶中OPN呈異常高表達，其有可能通過NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，刺激機體內(nèi)炎癥介質(zhì)釋放，使細胞因子表達增加，促進骨質(zhì)破壞。本研究經(jīng)Spearman相關(guān)系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，OPN、NF-κB表達水平與膽脂瘤侵襲程度呈正相關(guān)性(P<0.05)，且OPN與NF-κB表達水平呈正相關(guān)(P<0.05)，充分說明了兩種物質(zhì)能夠協(xié)同參與中耳膽脂瘤骨質(zhì)破壞的病理進程。

綜上所述，OPN、NF-κB在中耳膽脂瘤上皮組織中呈現(xiàn)異常陽性表達，且其陽性表達率會隨膽脂瘤上皮組織增殖及骨質(zhì)破壞的加重而增加，提示OPN有可能通過調(diào)節(jié)NF-κB的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑協(xié)同參與中耳膽脂瘤的發(fā)生發(fā)展，其對于判斷患者病情嚴重程度具有一定參考意義。