舒芬太尼對1-甲基-4-苯基-吡啶離子誘導的SH-SY5Y細胞損傷的影響及作用機制

熊昕麗，陳 迅

1 . 同濟大學附屬東方醫(yī)院 神經(jīng)內科 (上海 200120)；2.上海長寧區(qū)婦幼保健院 麻醉科 (上海 200051)

帕金森病是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、運動遲緩等。既往研究[1]顯示，氧化應激損傷是誘導帕金森病發(fā)生的主要原因。因而如何增強機體抗氧化應激能力，成為治療帕金森病的主要途徑。研究[2]表明，舒芬太尼(sufentanil，SF)可促進小鼠脊髓星形膠質細胞活化而修復周圍神經(jīng)損傷。SF可抑制大鼠腸缺血再灌注時肝組織損傷[3]。微小RNA-17-5p(microRNA-17-5p，miR-17-5p)在過氧化氫誘導的心肌細胞中呈高表達，并可加重心肌細胞損傷[4]。研究[5]表明，miR-17-5p在丙型肝炎患者血清中表達水平升高，并可促進疾病進展。TargetScan預測顯示，甲基化CpG結合蛋白(methyl-CpG-binding protein 2，MECP2)可能是miR-17-5p的靶基因。研究[6]表明，MECP2在帕金森細胞模型中的表達下降，其可能參與帕金森病的發(fā)病過程。上調MECP2 表達對腦缺血再灌注損傷大鼠的海馬神經(jīng)元發(fā)揮保護作用[7]。但SF是否通過調控miR-17-5p和MECP2表達，影響帕金森病的發(fā)生發(fā)展尚未可知。本研究采用1-甲基-4-苯基-吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+)誘導人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞損傷模型，觀察SF對SH-SY5Y細胞損傷模型是否具有保護作用，探究其是否通過調控miR-17-5p/MECP2表達而發(fā)揮作用，為揭示帕金森病發(fā)生發(fā)展的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SH-SY5Y細胞購自南京科佰生物科技有限公司；SF購自宜昌人福藥業(yè)有限責任公司；MPP+購自美國Sigma公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司；二 喹 啉 甲 酸 ( bicinchoninicacid，BCA) 蛋白定量試劑盒購自上海炎熙生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液購自北京百奧萊博科技有限公司；MECP2抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關蛋白( Bcl-2-associated X protein，Bax)抗體購自美國Santa Crutz公司；Trizol、逆轉錄及實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)試劑盒均購自日本TaKaRa公司；lipofectAMINE2000購自上海潤成生物科技有限公司；miR-17-5p 模擬物(miR-17-5p mimics)、陰性對照(miR-NC)、miR-17-5p特異性寡核苷酸抑制劑 (anti-miR-17-5p)及其陰性對照(anti-miR-NC)購自上海吉瑪制藥技術有限公司；pcDNA3.1購自上海索寶生物科技有限公司；熒光素酶報告基因載體及其活性檢測試劑盒均購自美國Promega公司；丙二醛( malondialedhyde，MDA) 活性檢測試劑盒購自上海嵐派生物科技有限公司；還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)檢測試劑盒購自上海炟雅生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗處理及分組 SH-SY5Y細胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)液內主要包含10%胎牛血清、青霉素及鏈霉素，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，待細胞生長密度達到90%左右時進行傳代。實驗分為Con組(細胞正常培養(yǎng)，不進行任何處理)、MPP+組(培養(yǎng)的細胞中加入質量濃度為1 mmol/L的MPP+培養(yǎng)24 h)[8]、MPP++SF-L組(培養(yǎng)的細胞中加入質量濃度為1×10-11mol/L的SF作用3 h后，再加入1 mmol/L的MPP+培養(yǎng)24 h)、MPP++SF-M組(培養(yǎng)的細胞中加入質量濃度為1×10-10mol/L的SF作用3 h后，再加入1 mmol/L的MPP+培養(yǎng)24 h)、MPP++SF-H組(培養(yǎng)的細胞中加入質量濃度為1×10-9mol/L的SF作用3 h后，再加入1 mmol/L的MPP+培養(yǎng)24 h)[9]。SH-SY5Y細胞轉染及分組：MPP++anti-miR-NC組(細胞中轉染anti-miR-NC 24 h后，再加入1 mmol/L的MPP+培養(yǎng)24 h)、MPP++anti-miR-17-5p組(細胞中轉染anti-miR-17-5p 24 h后，再加入1 mmol/L的MPP+培養(yǎng)24 h)、MPP++pcDNA組(細胞中轉染pcDNA 24 h后，再加入1 mmol/L的MPP+培養(yǎng)24 h)、MPP++pcDNA-MECP2組(細胞中轉染pcDNA-MECP2 24 h后，再加入1 mmol/L的MPP+培養(yǎng)24 h)、MPP++SF+miR-NC組(細胞中轉染miR-NC 24 h后，再加入1 mmol/L的MPP+、1×10-9mol/L的SF培養(yǎng)24 h)、MPP++SF+miR-17-5p組(細胞中轉染miR-17-5p mimics 24 h后，再加入1 mmol/L的MPP+、1×10-9mol/L的SF培養(yǎng)24 h)。

1.2.2 檢測細胞中MDA、GSH的含量 取各組SH-SY5Y細胞，采用比色法檢測細胞中MDA含量。取各組細胞上清液檢測GSH含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組SH-SY5Y細胞，0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞，磷酸鹽緩沖液( phosphate buffered saline，PBS)清洗細胞，加入500 μL Binding Buffer重懸細胞，加入5 μL膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)，充分混勻，加入5 μL碘化丙啶( propidium iodide，PI)，充分混勻，室溫避光孵育10 min，應用流式細胞儀檢測各組SH-SY5Y細胞凋亡情況。

1.2.4 qRT-PCR檢測細胞中miR-17-5p、MECP2 mRNA表達水平 采用Trizol法提取各組SH-SY5Y細胞總RNA，應用紫外分光光度計測定RNA濃度，按照逆轉錄試劑盒將2 ng RNA反轉錄為cDNA，miR-17-5p正向引物：5′-CCAGGATCCT TTATAGTTGTTAGAGTTTG-3′，反向引物：5′-CGGAATTCTAATCTACTTCACTATCTGCAC-3′；MECP2正向引物：5′-AAGTGGAGTTGATTG CGTAC-3′，反向引物：5′-GGCTTCTTAGGTGG TTTC-3′；U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAG CACA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATT TGCGT-3′；GAPDH正向引物：5′-AACGGATTT GGTCGTATTG-3′，反向引物：5′-GGAAGATGG TGATGGGATT-3′。引物均由上海生物工程股份有限公司合成，按照qRT-PCR檢測試劑盒說明書配置反應體系及設置反應程序，置于ABI 7500實時熒光定量PCR儀檢測，miR-17-5p以U6為內參，MECP2以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-17-5p、MECP2 mRNA的相對表達量。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測miR-17-5p靶基因 應用TargetScan預測miR-17-5p與MECP2-3′UTR存在結合位點，將含有miR-17-5p結合位點及突變結合位點的MECP2-3′UTR片段插入熒光素酶報告基因載體，構建WT-MECP2、MUT-MECP2載體，分別將WT-MECP2、MUT-MECP2與miR-17-5p mimics、miR-NC共轉染至SH-SY5Y細胞，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，檢測各組雙熒光素酶活性。

1.2.6 蛋白質印跡技術(Western blot)檢測MECP2、Bcl-2、Bax蛋白表達 取對數(shù)生長期SH-SY5Y細胞，每孔加入100 μL RIPA裂解液，收集細胞置于無菌無酶的EP管內，應用超聲破碎細胞后，轉速12 000 r/min，離心半徑6 cm，離心15 min，收集上清液(蛋白)，采用BCA法測定蛋白濃度，蛋白變性進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)，采用濕轉法轉膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗稀釋液(1∶1 000)，4 ℃搖床內孵育24 h，Tis-HCI緩沖液(TBST)洗滌3次×10 min，室溫條件下孵育二抗稀釋液(1∶2 000)2 h，TBST洗滌3次×10 min，增強型化學發(fā)光試劑(electrochemiluminescence，ECL)顯影，應用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 SF對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷的影響

與Con組相比，MPP+組SH-SY5Y細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，MDA含量明顯增高(P<0.05)，GSH含量明顯降低(P<0.05)，Bax蛋白的表達水平明顯升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白的表達水平明顯降低(P<0.05)；與MPP+組相比，MPP++SF-L組、MPP++SF-M組、MPP++SF-H組SH-SY5Y細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，MDA含量明顯降低(P<0.05)，GSH含量明顯升高(P<0.05)，Bax蛋白的表達水平明顯降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白的表達水平明顯升高(P<0.05)，SF不同劑量組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，呈劑量依賴效應(圖1、表1)。

組別MDA/(nmol/mg prot)GSH/(nmol/mg prot)凋亡率/%Bcl-2蛋白Bax蛋白Con0.31±0.0332.46±3.127.62±0.780.69±0.060.31±0.03MPP+7.03±0.69*10.45±1.08*28.32±2.14*0.25±0.03*0.76±0.06*MPP++SF-L5.21±0.51#16.18±1.64#22.32±2.28#0.36±0.04#0.64±0.06#MPP++SF-M3.14±0.31#△21.36±2.15#△15.36±1.47#△0.48±0.05#△0.53±0.05#△MPP++SF-H0.94±0.09#△&27.13±2.62#△&10.65±1.08#△&0.59±0.05#△&0.42±0.04#△&F429.152135.590235.714124.987115.709P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

注：與Con組比較，*P<0.05；與MPP+組比較，#P<0.05；與MPP++SF-L組比較，△P<0.05；與MPP++SF-M組比較，&P<0.05

2.2 SF對MPP+誘導SH-SY5Y細胞中miR-17-5p和MECP2表達的影響

與Con組相比，MPP+組SH-SY5Y細胞miR-17-5p表達水平明顯升高(P<0.05)，MECP2 mRNA及蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；與MPP+組相比，MPP++SF-L組、MPP++SF-M組、MPP++SF-H組SH-SY5Y細胞miR-17-5p表達水平明顯降低(P<0.05)，MECP2 mRNA及蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，SF不同劑量組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，呈劑量依賴效應(表2、圖2)。

組別miR-17-5pMECP2 mRNAMECP2 蛋白Con1.01±0.081.00±0.090.63±0.06MPP+2.84±0.25*0.34±0.03*0.21±0.03*MPP++SF-L2.33±0.19#0.52±0.05#0.33±0.03#MPP++SF-M1.84±0.18#△0.68±0.06#△0.42±0.04#△MPP++SF-H1.41±0.14#△&0.81±0.07#△&0.53±0.05#△&F150.716146.250128.274P<0.001<0.001<0.001

注：與Con組比較，*P<0.05；與MPP+組比較，#P<0.05；與MPP++SF-L組比較，△P<0.05；與MPP++SF-M組比較，&P<0.05

2.3 miR-17-5p靶向調控MECP2的表達

TargetScan預測顯示，MECP2的3′UTR中含有與miR-17-5p互補的核苷酸序列。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，與miR-NC、WT-MECP2共轉染組相比，miR-17-5p mimics、WT-MECP2共轉染組熒光素酶活性降低(P<0.05)；與miR-NC、MUT-MECP2共轉染組相比，miR-17-5p mimics、MUT-MECP2共轉染組熒光素酶活性無明顯變化。Western blot檢測結果顯示，miR-17-5p組SH-SY5Y細胞中MECP2蛋白表達水平低于miR-NC組(P<0.05)，anti-miR-17-5p組SH-SY5Y細胞中MECP2蛋白表達水平高于anti-miR-NC組(P<0.05)。由此表明，miR-17-5p可負向調控靶基因MECP2的表達(圖3、表3～4)。

注：A：MECP2的3′UTR中含有與miR-17-5p互補的核苷酸序列；B：MECP2蛋白表達

表3 雙熒光素酶報告實驗

表4 miR-17-5p調控MECP2蛋白的表達

注：與miR-NC組比較，*P<0.05；與anti-miR-NC組比較，#P<0.05

2.4 抑制miR-17-5p表達對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷的影響

相較于MPP++anti-miR-NC組，MPP++anti-miR-17-5p組SH-SY5Y細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，Bax蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，GSH含量明顯增加(P<0.05)，MDA含量明顯降低(P<005)(圖4、表5)。

表5 抑制miR-17-5p表達對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷的影響

注：與Con組比較，*P<0.05；與MPP++anti-miR-NC組比較，#P<0.05

2.5 MECP2過表達對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷的影響

相較于MPP++pcDNA組，MPP++pcDNA-MECP2組SH-SY5Y細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，Bax蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，GSH含量明顯增加(P<0.05)，MDA含量明顯降低(P<0.05)(表6、圖5)。

表6 MECP2過表達對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷的影響

注：與Con組比較，*P<0.05；與MPP++pcDNA組比較，#P<0.05

圖5 MECP2過表達對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞中MECP2和凋亡相關蛋白表達的影響

2.6 miR-17-5p過表達逆轉了SF對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷的作用

與MPP++SF+miR-NC組比較，MPP++SF+miR-17-5p組SH-SY5Y細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，miR-17-5p與Bax的蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，MECP2、Bcl-2蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，GSH含量明顯下降(P<0.05)，MDA含量明顯增高(P<0.05)(圖6、表7)。

圖6 miR-17-5p過表達逆轉了SF對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞中MECP2和凋亡相關蛋白表達的影響

表7 miR-17-5p過表達逆轉了SF對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷作用

注：與MPP+組比較，*P<0.05；與MPP++SF+miR-NC組比較，#P<0.05

3 討論

MPP+可選擇性作用于多巴胺神經(jīng)元而損傷腦黑質致密部多巴胺神經(jīng)元，從而出現(xiàn)帕金森病類似癥狀，MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷模型是帕金森病經(jīng)典的體外模型[10]。研究[11]表明，阿片類藥物可保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)免受氧化應激損傷，其中舒芬太尼具有作用效果好、不良反應小等優(yōu)點。但關于SF對帕金森病的治療效果及其可能作用機制尚未可知。本研究通過構建MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷模型，初步分析SF對SH-SY5Y細胞損傷的作用，為臨床合理應用SF奠定理論基礎。

SF可能通過上調神經(jīng)組織中堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)表達，從而促進小鼠周圍神經(jīng)損傷后再生及修復[12]。研究[13]表明，SF可通過激活核轉錄因子E2 相關因子 2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)/抗氧化物反應元件(antioxidant response elements， ARE)信號通路，抑制缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞凋亡及減少心肌梗死面積，從而有效減緩氧化應激損傷。本研究通過構建MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷模型，結果顯示，細胞凋亡率與MDA含量明顯升高，GSH含量明顯降低，提示模型構建成功。研究[14-15]表明，帕金森病發(fā)生發(fā)展過程與氧化應激有關，多巴胺可通過自身代謝產(chǎn)生的自由基與超氧陰離子等產(chǎn)物生成MDA，從而破壞細胞結構及功能，GSH屬于抗氧化酶類，其含量高低表示機體清除自由基能力的強弱。本研究結果顯示，SF處理后細胞中MDA含量明顯降低，GSH含量明顯升高，提示SF可通過提高GSH水平及降低MDA水平，增強其抗氧化能力。相關報道[16]指出，Bcl-2可抑制細胞凋亡，Bax可促進細胞凋亡，MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷的主要病理機制為MPP+可促使細胞內釋放大量的活性氧自由基，提高Bax的表達水平，降低Bcl-2的表達水平，促進細胞凋亡。本研究結果顯示，SF可明顯抑制Bax的表達及促進Bcl-2的表達，隨著SF使用劑量的增加而明顯變化，提示SF可能通過上調Bcl-2的表達及下調Bax的表達，抑制MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡。

miRNA可通過調控下游靶基因表達從而調控腦部學習及記憶等功能。研究[17-18]表明，miR-17-5p特異性表達于神經(jīng)組織，其表達量增加可通過抑制神經(jīng)細胞(PC12細胞)增殖，損傷細胞結構及功能，進一步研究顯示，miR-17-5p過表達可通過促進Bax蛋白表達及抑制Bcl-2表達從而損傷PC12細胞結構及功能。本研究結果顯示，MPP+誘導的SH-SY5Y細胞中，miR-17-5p表達水平明顯升高，SF處理后可明顯抑制miR-17-5p表達，隨著藥物濃度的增加而明顯抑制，進一步研究顯示，抑制miR-17-5p表達后，MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡率降低，MDA水平與Bax的表達水平降低，GSH水平與Bcl-2的表達水平升高，提示SF可能通過抑制miR-17-5p表達而減緩SH-SY5Y細胞氧化損傷。本研究通過雙熒光素酶報告實驗與Western blot實驗證實，miR-17-5p可負向調控靶基因MECP2的表達。研究[19-20]表明，MECP2在神經(jīng)元退變及凋亡等方面發(fā)揮重要調控作用，其表達量降低導致神經(jīng)元功能降低，MECP2過表達可抑制6-羥多巴胺誘導的SH-SY5Y細胞凋亡，促進細胞存活。本研究結果顯示，MPP+誘導的SH-SY5Y細胞中MECP2的表達水平明顯降低，SF可明顯提高MECP2的表達水平，進一步研究顯示，MECP2過表達可通過增強細胞抗氧化能力及抑制細胞凋亡，從而保護SH-SY5Y細胞免受氧化應激損傷。提示SF可能通過下調miR-17-5p表達及上調MECP2表達從而對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷發(fā)揮保護作用。為驗證上述推測，本研究深入分析發(fā)現(xiàn)，miR-17-5p過表達可逆轉SF對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用，證實SF可通過調控下調miR-17-5p表達及上調MECP2表達，從而減輕MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷，為SF治療帕金森病提供理論依據(jù)。

綜上所述，SF可在體外劑量依賴性地減輕MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷，其作用機制可能是SF通過調控miR-17-5p/MECP2表達抑制細胞氧化應激及細胞凋亡，可為臨床治療帕金森病提供新方向。但關于SF對帕金森病患者的治療效果及安全性等還需臨床試驗進行驗證。