乙肝肝硬化早期患者外周血環狀RNA差異表達譜的研究*

杜紅飛，龐雪利，陽 燕，周曉萍，許 穎

成都醫學院第一附屬醫院 檢驗科 (成都市 610500)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染在全世界范圍內普遍流行，其感染可發展為乙肝肝硬化、乙肝性肝癌及肝衰竭等終末期肝病，嚴重危害人類健康[1]。乙肝肝硬化早期肝細胞受到損害，但由于肝臟具有強大的代償能力，患者的臨床表現不明顯，至終末期不可逆轉的肝病發生率增加，病死率增加。因此，探究該疾病早期的生物學標志物，給予早期阻斷、治療，對改善乙肝肝硬化的預后具有重要的臨床意義。

環狀RNA(circular RNA, circRNA)是近幾年新發現的一類非編碼RNA，由內含子或外顯子通過非經典剪接方式形成閉合環狀結構, 廣泛見于多種真核細胞生物[2]。circRNA由于其結構的獨特性，不具有5'端帽子和 3'末端poly(A)尾巴結構，不易被核酸外切酶RNaseR和分支酶降解[3]，因而更具有穩定和高度保守性的特性[4]。目前國內外研究[5-6]顯示，circRNA在肝纖維化、肝硬化和肝癌的進程中起著重要作用。然而，對乙肝肝硬化早期患者的外周血circRNA表達差異的相關研究，尚未見報道。因此，本研究對正常體檢者和乙肝肝硬化早期患者外周血進行circRNA芯片檢測，旨在為乙肝肝硬化進行早期預測、診斷和治療提供實驗理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018年1月1日至2018年10月31日成都醫學院第一附屬醫院初次確診為慢性乙型肝炎患者(參照中華醫學會2015年版慢性乙型肝炎診斷標準) ,且經肝穿刺活檢病理診斷為早期肝硬化(不合并其他任何疾病)的3例患者作為試驗組，皆在臨床藥物治療前靜脈抽取其EDTA抗凝的全血標本。另選取該段時間內3名健康體檢者作為對照組，靜脈抽取患者EDTA抗凝的全血標本，并凍存于-80 ℃冰箱保存。所有納入該項試驗的研究者均排除肝癌、其他病毒性肝炎、酒精性肝炎等肝病及其他重要器官系統疾病，且研究對象均知情同意參加本項試驗。

1.2 主要試劑和材料

Trizol試劑 (invitrogen life technologies，美國)，circRNA微陣列芯片，熒光標記cRNA的Arraystar Super RNA Labeling(Arraystar，美國)試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 提取樣本總RNA 試驗組和對照組樣本分別由3例乙肝肝硬化早期患者全血和3名健康體檢者全血混合組成(每個樣本1 mL)，采用Trizol法分別提取兩組混合全血的總RNA, 利用NanoDrop ND-1000及瓊脂糖凝膠電泳法評價總RNA的濃度、完整性及純度，總RNA A260/A280比值為1.8～2.1，且A260/A230比值>1.8后用于circRNA芯片檢測。

1.3.2 circRNA微陣列芯片 利用NanoDrop ND-1000對提取的總RNA進行濃度和純度檢測。采用Arraystar標準方案制備樣本并進行芯片雜交：先用Rnase R(Epicentre, Inc.，美國)消化總RNA用以去除線性RNA并富集環狀RN, 后采用隨機引物的方法(Arraystar super RNA labeling kit; Arraystar，美國)擴增富集的circRNA并轉錄成帶熒光標記的cRNA。再利用RN easy Mini Kit(Qiagen，德國)對cRNA進行純化并使用NanoDrop ND-1000檢測cRNA濃度和活性。最后將標記熒光的cRNA與Arraystar Human circRNA Array V2 (8x15K, Arraystar，美國)雜交。Agilent清洗液試劑盒清洗芯片后，用Agilent G2505C掃描。

1.3.3 circRNA芯片數據采集與分析 將掃描獲得的芯片圖，用Agilent Feature Extraction(11.0.1.1版)進行解析獲得原始數據，然后利用R語言中的limma對數據進行歸一化和后續的數據處理。計算每個circRNA分子在組間的fold change值，并將fold change絕對值≥2.0的circRNA認為在組間有明顯差異。有明顯差異的circRNA繪制成散點圖，并利用Arraystar基于TargetScan和miRanda數據庫獨立開發的miRNA靶向結合位點預測軟件，預測circRNA可能吸附的miRNA。針對microRNA對應的靶基因做GO與KEGG分析，查看富集的生物學過程。

2 結果

2.1 RNA的質量

試驗組和對照組對應樣本的OD260/280比率均為1.8～2.1，D值260/230>1.8；兩組瓊脂糖變性凝膠電泳條帶清晰，可進一步行circRNA芯片檢測(表1)。

表1 總RNA濃度和質量

注：L1～L3為乙肝肝硬化早期患者，C1～C3為健康體檢者

2.2 差異表達circRNA的散點圖

利用生信工具，將試驗組和對照組分析獲得的差異circRNA，繪制成散點圖(圖1)。結果顯示，與對照組比較，試驗組外周血中異常表達的circRNA共有1 447個(fold change絕對值≥2.0)，上調的777個(fold change≥2.0)，差異倍數>25的6個；下調的670個 (fold change≤-2.0)，差異倍數>10的4個(表2～3)。

注：橫坐標代表對照組芯片歸一化的信號值，縱坐標代表試驗組芯片歸一化的信號值。頂部綠線上部表示上調的circRNA(fold change絕對值≥2.0)，底部綠線下部表示下調的circRNA(fold change絕對值≤-2.0)

表2 乙肝肝硬化早期試驗組相對健康對照組表達上調的circRNA

circRNA名稱fold change絕對值circRN類型circRNA基因定位hsa_circRNA_00106769.3705772intronicRP11-351M8.1hsa_circRNA_10480566.3027246exonicUBQLN1hsa_circRNA_03347537.0519385exonicMARK3hsa_circRNA_10149133.3180296exonicMAPKBP1hsa_circRNA_10263132.6992814exonicNBAShsa_circRNA_05064828.3354974exonicHSPB6

表3 乙肝肝硬化早期試驗組相對健康對照組表達下調的circRNA

circRNA名稱fold change絕對值circRN類型circRNA基因定位hsa_circRNA_103210-12.0704585exonicMYH9hsa_circRNA_105039-11.8866749exonicFLNAhsa_circRNA_000317-11.4070745intronicAHNAKhsa_circRNA_092022-10.4976948exonicFLNA

2.3 差異表達的circRNA與miRNA結合位點預測

利用在線數據庫， TargetScan和miRanda預測每個差異circRNA的5個miRNA結合位點，發現hsa_circRNA_102631，hsa_circRNA_102893，hsa_circRNA_104748，hsa_circRNA_044370，hsa_circRNA_005356，hsa_circRNA_102007，hsa_circRNA_104683，hsa_circRNA_104971，hsa_circRNA_101183，hsa_circRNA_101798，hsa_circRNA_102612，hsa_circRNA_101639，hsa_circRNA_101905，hsa_circRNA_100356r，hsa_circRNA_100969與hsa_circRNA_101837與hsa_circRNA_100049與肝硬化相關的miR-18a-5p、miR-29c-3p、miR-106b-5p、miR-185-5p具有結合位點(表4)。

表4 差異表達的circRNA與下游靶向吸附miRNA的預測

2.4 差異circRNA的功能分析

對篩選出的差異circRNA所涉及的基因進行GO和KEGG分析，發現差異表達在調節基因表達、細胞代謝及RNA轉錄等功能方面高度富集。同時，KEGG分析揭示，差異circRNA下游主要涉及MAPK、FoXO、Ras及腫瘤相關的信號通路(圖2～3)。

注：A:上調差異circRNA的GO富集分析；B:下調差異circRNA的GO富集分析。橫坐標代表enrichment score值，縱坐標代表富集到的GO條目名稱

注：A:上調差異circRNA的KEGG富集分析；B:下調差異circRNA的KEGG富集分析。橫坐標代表enrichment score值，縱坐標代表KEGG通路名稱

3 討論

circRNA是1976年在植物病毒中發現的一種新類型閉合環狀非編碼RNA，其穩定地表達于真核細胞中。研究[7]發現，circRNA可通過多種方式發揮基因表達、蛋白質翻譯及線性RNA的生成調控的功能，如競爭內源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)，結合miRNA而調節miRNA的表達水平；海綿作用吸附miRNA，解除miRNA對一些mRNA的去阻遏[8]；同時，circRNA也可通過與其他蛋白或因子相互結合形成復合物發揮調控功能[9]。近年來，大量研究[10]證實，circRNA與人類多種疾病的發生、發展具有密切相關性：hsa_circ_0014130高表達于非小細胞肺癌組織中，與癌組織的臨床特征具有一定的相關性；Zheng等[11]利用circRNA芯片技術揭示，circ_402458異常表達于原發性膽管炎患者的血漿中，可能為其臨床診療的生物學標志物；Li等[12]通過體外實驗發現，Cir-ITCH可海綿吸附miR-7、miR-17、miR-124至ITCH表達上調，進而抑制Wnt信號通路，在食管鱗狀細胞癌中發揮抑癌作用；在結直腸癌中存在circRNA的表達與細胞增殖呈負相關，進一步研究[13]揭示，結腸癌患者與健康人群的血清外泌體中存在circRNA的表達差異，可作為結腸癌的血清標志物等。另外，有研究[14]發現，circRNA參與肝癌的發生發展，如circFBLIM1高表達于肝癌中，可競爭性結合miR-346，上調FBLIM1的表達，促進HCC細胞的增殖和侵襲；Zhang等[15]研究發現，circRNA-104075在HCC患者血清、組織和細胞中均呈現高表達，細胞水平上可吸附miR-582-3p而抑制致癌通路YAP的表達，從而加速HCC的發生發展。由此可見，circRNA可能為未來多種疾病診斷的新型標志物或治療靶點。然而，對于乙肝肝硬化早期外周血的circRNA尚無研究。

然而，目前circRNA在乙肝肝硬化早期患者外周血中的表達研究尚處于空白。因此，本研究運用circRNA微陣列芯片技術檢測乙肝肝硬化早期和健康體檢者外周血circRNA表達譜。與對照組比較，發現乙肝肝硬化早期外周血中差異表達的circRNA有1 447個，其中表達上調的有777個，差異倍數>25倍的6個；表達下調的有670個，差異倍數>10倍的4個，揭示circRNA可能與乙肝肝硬化早期的發生發展密切相關。進一步運用生物信息分析軟件對差異circRNA所涉及的基因進行GO和KEGG分析，結果顯示，差異circRNA主要在調節基因表達、細胞代謝及RNA轉錄等功能方面高度富集。與此同時，利用在線數據庫預測了circRNA的5個靶向 miRNA結合位點，并查閱相關文獻，提示miR-18a-5p、miR-29c-3p、miR-106b-5p、miR-185-5p與肝硬化相關，而hsa_circRNA_102631，hsa_circRNA_102893，hsa_circRNA_104748，hsa_circRNA_044370，hsa_circRNA_005356，hsa_circRNA_102007，hsa_circRNA_104683，hsa_circRNA_104971，hsa_circRNA_101183，hsa_circRNA_101798，hsa_circRNA_102612，hsa_circRNA_101639，hsa_circRNA_101905，hsa_circRNA_100356，hsa_circRNA_100969、hsa_circRNA_101837與這些miRNA存在結合位點，據此推測這些circRNA可能通過靶向吸附miR-18a-5p、miR-29c-3p、miR-106b-5p和miR-185-5p來調控乙肝肝硬化的發生和發展。由于本研究僅在3例乙肝肝硬化早期中進行了芯片檢測，差異circRNA將在后期的臨床標本及細胞水平中進行驗證，以明確circRNA為乙肝肝硬化早期重要的分子靶點和生物學標志物。另外，乙肝肝硬化早期的發生和發展存在復雜的調控機制，后期課題組也將重點關注差異circRNA與miRNA，蛋白質或基因表達的調控網絡。

綜上所述，circRNA在乙肝肝硬化早期患者外周血中的表達差異，提示circRNA可能與乙肝肝硬化早期的發病具有密切相關性。以上研究結果為進一步探究乙肝肝硬化早期的發生發展提供了實驗基礎，為未來circRNA應用于乙肝肝硬化臨床早期預測、診斷和靶向治療的研究提供了理論依據。