巖藻甾醇對卵巢癌細(xì)胞抑制作用的體外研究△

楊 玲 鄭超群 吳福珍 許燕麗（深圳市寶安區(qū)石巖人民醫(yī)院婦產(chǎn)科 深圳 518108）

卵巢癌（ovarian carcinoma）是女性常見惡性腫瘤之一，惡性程度高，預(yù)后不良。通過藥物抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、分化是主要的治療策略。但很多藥物使用后會導(dǎo)致細(xì)胞的耐藥，因此尋找一種更有效的藥物是治療的關(guān)鍵[1]。巖藻甾醇是從褐藻中提取的一種成分。研究表明[2]巖藻甾醇具有抗腫瘤、抗氧化作用。Peroxiredoxins（Prxs）是近些年出現(xiàn)的抗氧化酶系，包括Prx I-Ⅵ[3]，PrxⅢ與眾不同，在清除活性氧中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。本研究探索巖藻甾醇是否通過靶向Prx III誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞分化，為卵巢癌的診治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試劑及儀器：HO8910、HRA及SKOV細(xì)胞系（廣東凱普生物科技公司）；氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）（上海西澤斯生物公司）；RPMI-1640培養(yǎng)液（美國Sigma公司）；兔抗鼠PrxⅢ單克隆抗體、HRP標(biāo)記的二抗（上海鼎國生物有限公司）；巖藻甾醇（象山康瑞達(dá)生物工程有限公司）（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥90%）；流式細(xì)胞計數(shù)儀、酶標(biāo)儀SpectraMax M5（上海美谷分子）；倒置相差顯微鏡（上海美谷分子）；低溫高速離心機(jī)（北京卓立漢光儀器有限公司）；SDS-PAGE凝膠電泳及轉(zhuǎn)移裝置（北京華夏科創(chuàng)儀器有限公司）；LAS400凝膠成像系統(tǒng)（德國凱沃生物公司）。

1.2 實驗分組：取傳代3次的細(xì)胞，細(xì)胞密度5×103/mL，取2 mL加入6孔板。對照組不加入藥物，實驗組分別為0.1 mmol/L巖藻甾醇組、0.2 mmol/L巖藻甾醇組、0.4 mmol/L巖藻甾醇組。每組3個復(fù)孔，37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞形態(tài)觀察：取傳代培養(yǎng)3代的細(xì)胞，接種于6孔板，加入不同濃度的巖藻甾醇。培養(yǎng)24、48、96 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4 MTT檢測細(xì)胞增殖能力：將各組細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞濃度調(diào)整為5×103個/孔，培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后酶標(biāo)儀測量OD值。細(xì)胞生長抑制率（IC）=（1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期：各組細(xì)胞胰酶消化，離心，PBS洗滌3遍，離心，PBS重懸，室溫培養(yǎng)1 h，75%乙醇固定20 min，PBS洗滌3遍，加入10 mL PI避光條件下4℃孵育1 h。流式細(xì)胞儀檢測激發(fā)光Ex=488 nm處的熒光強(qiáng)度。

1.6 Western blot檢測PrxⅢ蛋白量表達(dá)：小心吸去培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞，裂解液裂解細(xì)胞，冰浴30 min，40℃ 1 500 r/min離心5 min，吸去上層液體，超聲波破核，再次離心，取上層液體10 μL 待測。配膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，切膜，封閉液封閉 1 h，逐次鼠抗人PrxⅢ多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠二抗。Bio-Rad成像儀曝光成像，Image Lab Software測定光密度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法：數(shù)據(jù)使用SPSS17.0軟件處理，計量資料采用（±s）表示，行 t檢驗；計數(shù)資料使用（%）表示，行 χ2檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：對照組細(xì)胞多為類圓形或橢圓形，外表規(guī)整，成簇生長。經(jīng)巖藻甾醇處理的細(xì)胞發(fā)生類圓形-星狀-梭形的形態(tài)轉(zhuǎn)變。0.4 mmol/L巖藻甾醇組的細(xì)胞在形態(tài)上發(fā)生明顯改變，細(xì)胞密度也顯著下降。見圖1。

2.2 巖藻甾醇對細(xì)胞增殖、凋亡的影響：MTT結(jié)果顯示，與對照組相比，巖藻甾醇降低了細(xì)胞增殖率，且呈濃度增加，增殖率越來越低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，與對照組比較，加入巖藻甾醇后的細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞增加，S期細(xì)胞減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 3、表 1。

表1 各組不同周期細(xì)胞分布比較（%，±s）

表1 各組不同周期細(xì)胞分布比較（%，±s）

注：與對照組比較，* 為 P＜0.05。

組別 G 0/G 1期 S期對照組0.1 m m o l/L巖藻甾醇組0.2 m m o l/L巖藻甾醇組0.4 m m o l/L巖藻甾醇組5 9.3 6±2.3 0 7 5.3 9±3.8 4*8 1.9 3±1.7 3*8 8.0 3±2.1 5*2 7.0 4±1.3 2 4.0 5±1.4 4*3.8 5±0.6 4*2.5 4±0.6 4*

2.3 各組PrxⅢ蛋白量表達(dá)：Western blot結(jié)果顯示，4組PrxⅢ蛋白量存在顯著差異（F=18.053，P=0.000）。0.1 mmol/L巖藻甾醇組PrxⅢ蛋白量高于對照組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.827，P=0.133）；0.2 mmol/L巖藻甾醇組PrxⅢ蛋白量高于0.1 mmol/L巖藻甾醇組（t=2.326，P=0.032）；0.4 mmol/L巖藻甾醇組PrxⅢ蛋白量高于0.2 mmol/L巖藻甾醇組（t=7.923，P=0.014）。見圖4。

3 討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡是治療惡性腫瘤的常用方法。但藥物耐藥性、有效性等問題給治療帶來了新課題[4]。因此，尋找一種新型藥物及治療靶點成為目前研究的熱點。

研究表明，巖藻甾醇具有抗腫瘤、抗炎作用，能夠誘導(dǎo)急性早幼粒性白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）細(xì)胞分化。研究顯示，巖藻甾醇具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病分化[5-6]。但是巖藻甾醇對于其他腫瘤的生物學(xué)效應(yīng)研究還未見報道。毛正等[7]研究表明，巖藻甾醇可以顯著抑制肺癌細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果顯示，巖藻甾醇使卵巢癌細(xì)胞出現(xiàn)偏心細(xì)胞核，核漿比例減少等細(xì)胞分化表現(xiàn)。細(xì)胞生長和增殖失控是腫瘤的主要特征之一，細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生物學(xué)行為方面的異常均參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8-11]。細(xì)胞增殖與分化是由細(xì)胞周期中的G1期或G1/S期控制[12]。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，巖藻甾醇組細(xì)胞增殖率降低，G0/G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例減少，提示巖藻甾醇能誘導(dǎo)細(xì)胞增殖抑制并使細(xì)胞周期阻滯。

Prx III屬于 Peroxiredoxins（Prxs）家族，存在于線粒體，在抗氧化、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期中起到至關(guān)重要的作用[13]。實驗表明[14]，HeLa細(xì)胞中Prx III含量明顯大于谷胱甘肽過氧化物酶（GPxl），提示Prx III為主要抗氧化酶。另有研究提示HeLa細(xì)胞Prx III含量與H2O2水平呈負(fù)相關(guān)[15-17]。目前對于巖藻甾醇與PrxⅢ的關(guān)系不詳。本研究表明，巖藻甾醇組PrxⅢ水平高于對照組，且隨著濃度的增加，PrxⅢ蛋白量越高，說明巖藻甾醇誘導(dǎo)卵巢癌低分化可能與PrxⅢ有關(guān)。

本研究也有不足之處，我們并未對其他靶基因與相關(guān)通路研究，今后我們對相關(guān)通路分析、驗證，希望為卵巢癌的診治提供思路。

總之，巖藻甾醇可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的分化，其機(jī)制可能與Prx III有關(guān)，本次研究為卵巢癌的藥物開發(fā)開辟新的思路。