高效液相色譜法測定復方丹參方中4種成分研究

劉丹丹（福建中醫藥大學附屬漳州市中醫院 漳州 363000）

復方丹參方是傳統中醫中最為經典、常用的活血化瘀、理氣止痛方劑，是心血管疾病治療常用藥物，由丹參、三七及冰片構成[1]。近年來，關于復方丹參方的藥效和活性成分的研究越來越多，通常是以方中的丹參或者三七單個作為成分研究的對象，很少將兩者主要活性成分在同個指紋圖譜中體現。筆者基于既往研究，建立HPLC法于同一色譜條件下便捷、迅速檢測出復方丹參方內丹參中4種主要活性成分，以期為該藥物的藥效和質量評定提供依據，現報道如下。

1 試藥及儀器

1.1 試藥：復方丹參片（廣州白云山制藥股份有限公司，國藥準字Z44023372，批號20180912）；對照品包括三七皂苷R1（含量95%）、人參皂苷 Rg1（含量 92%）、丹參酮 IIA（含量 99%）、丹酚酸B（含量94%），均用于含量測定。甲醇、乙腈為色譜純，磷酸、鹽酸作為分析純，水為怡寶純凈水。

1.2 儀器：選用美國安捷倫科技公司生產的Agilent 1100型高效液相色譜儀及配套色譜工作站；北京賽多利斯公司生產的MS205DU型電子天平（感量0.1 mg）；上海必能信公司生產的SB2200型超聲波清洗機（50 Hz）。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液制備：精密測定復方丹參片20片，研磨成粉末狀，精密稱取300 mg，置入錐形瓶，再稱取70%甲醇20 mL加入，然后超聲提取30 min，靜置變冷，稱總量，用70%甲醇補充減少的量，搖勻，再緩緩過濾，取續濾液，溶液需超過孔徑0.45 μm 濾膜，即得。

2.1.2 對照品溶液制備：分別精密量取丹酚酸B（60 μg/mL）、人參皂苷 Rg1（10.2 mg/mL）、三七皂苷 R1（1.05 mg/mL）及丹參酮ⅡA（40 μg/mL）為對照品，加甲醇制成混標溶液和單標溶液。

2.2 色譜條件：色譜柱為Waters Acquity UPLC C18；流動相為0.02%磷酸（A）和含0.02%磷酸的80%乙腈（B）；梯度洗脫，柱溫控制在40℃；流速設為0.42 mL/min；檢測波長設為203 nm；流動相梯度為 0～0.8 min，90%（A）～80%（B），4～10 min 75%（A）～25%（B），10 min95%（B）[2]。

2.3 流動相及檢測波長選擇：本項研究中，檢測波長為203 nm，甲醇的短波長度會吸收紫外線，這會影響皂苷的色譜峰測定。因此，甲醇不能用作流動相。樣品中含有酚酸，所以在流動相中加入酸溶液以避免酚酸類物質水解，而甲酸或者乙酸在低波長下會吸收紫外線，選定流動相為乙腈-0.1%磷酸梯度本研究中的洗脫。

通過對三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、丹酚酸B、丹參酮IIA的紫外線檢測，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1在203 nm低波長處出峰；丹酚酸B在281 nm處最大吸收；丹參酮IIA于270 nm處最大吸收。

按照色譜條件測定樣品溶液內的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、丹酚酸B、丹參酮IIA含量，顯示4種成分和相鄰成分分離度良好，如圖1。

2.4 方法考察

2.4.1 線性分析：吸取混合對照品溶液用0.45 μm孔徑的濾膜濾過，于本研究色譜條件下分別進樣 1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、20 μL 及 40 μL，記錄色譜峰面積。橫坐標為濃度（X），縱坐標峰為面積（Y），繪制標準曲線圖，再行線性回歸分析，4種成分標準曲線方程、線性范圍以及相關系數[3]。見表1。

表1 復方丹參方中的4種活性成分的線性關系

2.4.2 重復性試驗：取復方丹參片按樣品制備法分別平行制備4份樣品溶液，依照既定實驗色譜條件測定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、丹酚酸B、丹參酮IIA平均含量。見表2。

表2 HPLC檢測復方丹參方中4種活性成分的重復性

2.4.3 穩定性試驗：取復方丹參片樣品溶液，按照本研究色譜條件，分別在 0、2、4、6、8 h 測定、記錄色譜圖，計算出丹酚酸 B、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1及丹參酮IIA的峰面積的RSD。結果顯示各成分含量依次是0.93%、0.33%、0.68%、0.93%、0.87%，該溶液在避光密閉容器中保存8 h內的含量變化不大，相對穩定。

2.4.4 精密度試驗：取混合對照品制成高、中、低濃度質控品，按“2.3”項下操作處理，每一濃度連續進樣5次，通過標準曲線算出含量，并算日內精密度。見表3。

表3 UPLC檢測復方丹參方中4種活性成分的精密度

2.4.5 回收率實驗：精密稱取復方丹參片0.5 g，置于50 mL量瓶，超聲振蕩，平行3組，精密加入高、中、低劑量三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、丹酚酸B及丹參酮ⅡA對照品，按“2.2”項下色譜條件測定，計算4種成分回收率。見表4。

表4 HPLC檢測復方丹參方中4種活性成分的回收結果

3 討論

中藥復方是由辨證論治后，選擇適當、合理劑量的藥物，嚴格按照組成原則進行配伍組合制成的組合藥劑。這種處方中所含有效活性成分多樣且復雜，準確有效選擇控制指標是研究難點。本研究基于《中國藥典》及研究文獻，丹參含有豐富水溶性成分與脂溶性成分，選擇水溶性成分中的丹酚酸B與脂溶性成分中的丹參酮IIA用作指示性指標。三七的主要成分為皂苷，最終選取三七人參皂苷R1、人參皂苷Rg1作為指標成分，選定的指標成分不但有代表性，而且有著良好科學性和客觀性。

在相同波長下檢測含發色團與輔助色團等4種活性成分，先要對本研究結果中的成分進行全波長掃描，具體表現為三七皂苷R1、人參皂苷Rg1在203 nm低波長處出峰，丹酚酸B在281 nm處最大吸收；丹參酮IIA于270 nm處最大吸收，這是因為發色團與輔助色團中的三種皂苷較少，單單在低波長下可以檢測到，原因在于波長203 nm處會有末端吸收，通過連續調整流動相比例，使檢測活性成分吸收峰和末端吸收峰分離度高于1.5，最后以末端吸收203 nm作為色譜條件。同時，使用HPLC測定活性成分，并在10 min內清晰顯示色譜圖，分析所需時間更少，分離度更高，可提高檢測效率，節省人力、物力[4-8]。其次，參考《中國藥典》等文獻，通過調整流動相比例，比較流動相是0.02%磷酸水和含0.02%磷酸80%的甲醇-水、水-乙腈、醋酸水-乙腈時所得色譜圖，最終選擇乙腈作為流動相進行成分檢測。從本研究結果看，采用HPLC法測定復方丹參方中丹酚酸B、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1及丹參酮IIA濃度和峰面積均有良好線性關系（r＞0.97）；同時，丹酚酸 B、人參皂苷 Rg1、三七皂苷R1及丹參酮IIA的平均提取回收率分別是99.42%、96.99%、97.04%、97.13%，精密度RSD均＜3.0%，且有著良好重復性、穩定性，能滿足測定要求。

綜上所述，對臨床廣泛應用的復方丹參方劑內4種常見活性成分進行測定，是對藥物質量控制和管理的拓展和補充。HPLC測定復方丹參方中的丹酚酸B、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1及丹參酮IIA等活性成分有重要價值，且有高精密度、重復性及穩定性。