2型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血清25(OH)D3血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子整合素αvβ3的表達(dá)

張東銘 張 錦 崔婷婷 張 靜 曹會(huì)芳

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450003

糖尿病(diabetes mellitus，DM)可引起多種眼病，如青光眼、黃斑變性、視網(wǎng)膜病變等，其中以糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)最常見(jiàn)，是糖尿病患者致盲的主要原因。一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查顯示，中國(guó)的DR患病率已達(dá)到34.08%，特別是在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)，非增殖性DR更常見(jiàn)[1]。長(zhǎng)期以來(lái)，多認(rèn)為DR的發(fā)生與周細(xì)胞丟失、視神經(jīng)網(wǎng)膜異常、新生血管形成、糖基化終產(chǎn)物、多元醇-肌醇代謝異常、二酰甘油-蛋白激酶C系統(tǒng)、氧化應(yīng)激和自由基、炎癥反應(yīng)、血流動(dòng)力學(xué)障礙、生長(zhǎng)因子及細(xì)胞凋亡等機(jī)制有關(guān)，迄今為止具體發(fā)病機(jī)制尚不明確。

維生素 D(vitamin D)是一種脂溶性維生素，主要在調(diào)節(jié)鈣磷代謝及骨代謝方面起重要作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，維生素D與DM及其慢性并發(fā)癥相關(guān)[2-3]。因此，25-羥維生素D3[25-hydroxy vitamin D，25(OH)D3]與DR的關(guān)系成為研究熱點(diǎn)。血管生成分子包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族蛋白和受體，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和整合素(integrin)。VEGF是目前已知的與DR新生血管形成最緊密的一個(gè)細(xì)胞因子。大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，整合素αvβ3被鑒定為血管生成的標(biāo)志，其受體在視網(wǎng)膜缺血缺氧狀態(tài)下產(chǎn)生新生血管過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4]。維生素D可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，減少整合素αvβ3表達(dá)，減少血管生成[5]。

鑒于DR的發(fā)生與VEGF、生長(zhǎng)因子受體與整合素間存在多種影響，且維生素D與血管內(nèi)皮的生成有著直接關(guān)系，本文探討T2DM患者DR病變程度與血清25(OH)D3、VEGF、整合素αvβ3的關(guān)系，并預(yù)測(cè)其在DR發(fā)生發(fā)展中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象選擇2019-03-06在鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院就診并住院的189例T2DM患者。根據(jù)是否有糖尿病視網(wǎng)膜病變，將T2DM患者分為NDR組(52例)和DR組(137例)。排除標(biāo)準(zhǔn)：1型糖尿病及各種糖尿病急性并發(fā)癥；妊娠期糖尿病；合并急性感染、嚴(yán)重肝腎功能不全、心腦血管疾病、代謝性骨病。所有患者近半年內(nèi)均未服用過(guò)任何鈣劑、維生素D、抗精神病藥物；眼底檢查合并白內(nèi)障、青光眼等影響眼底觀察的其他眼部疾病。

1.2研究方法(1)臨床資料及生化指標(biāo)檢測(cè)：收集患者體重指數(shù)(BMI)、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、糖尿病病程等信息。禁食8 h，抽取5 mL空腹靜脈血，測(cè)空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)、尿素氮(BUN)、肌酐(SCR)、檢測(cè)血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)，高密度脂蛋白(HDL)、糖化血紅蛋白(HbAlc)。采用德國(guó)羅氏電化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)25-羥維生素D3水平。(2)收集患者靜脈血，室溫下靜置2 h，1 200 r/min離心20 min，將血清分裝-80 ℃凍存?zhèn)溆茫捎秒p抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)(試劑盒購(gòu)于江蘇晶美生物科技有限公司)檢測(cè)血清VEGF、整合素αvβ3的表達(dá)水平。(3)眼底照相檢查：所有患者常規(guī)于眼科門(mén)診散瞳后行眼底照相。采用糖尿病視網(wǎng)膜病變國(guó)際臨床分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(2002年)對(duì)眼底病變進(jìn)行分級(jí)診斷[6]。

2 結(jié)果

2.12組一般資料與臨床指標(biāo)比較DR組與NDR組比較，血清25(OH)D3水平下降，BMI、SBP、FPG、TG、VEGF、整合素αvβ3水平明顯升高(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組一般資料及臨床生化指標(biāo)比較

2.22型糖尿病患者血清25(OH)D3與各指標(biāo)的相關(guān)性分析以25(OH)D3為因變量，各指標(biāo)為自變量行Spearman相關(guān)分析，結(jié)果顯示，血清25(OH)D3水平與年齡、BMI、HbA1c、FINS、FPG、VEGF、αvβ3、有無(wú)糖尿病視網(wǎng)膜病變均呈明顯負(fù)相關(guān)(r分別為-0.146、-0.230、-0.255、-0.164、0.166、-0.318、-0.338、-0.192)；其中VEGF與αvβ3正相關(guān)(r=0.232、P=0.001)。見(jiàn)表2。

表2 各指標(biāo)與血清25(OH)D3水平的相關(guān)性分析

2.4Logistic回歸分析DR的影響因素 以有無(wú)DR為因變量，以糖尿病病程、BMI、SBP、25(OH)D3、αvβ3水平為自變量，行Logistic回歸分析，校正混雜因素后，結(jié)果顯示：病程、BMI、SBP、αvβ3水平水平是 DR的危險(xiǎn)因素，25(OH)D3是DR的保護(hù)因素。見(jiàn)表3。

表3 Logistic回歸分析DR的影響因素

2.5VEGF及αvβ3預(yù)測(cè)DR的價(jià)值將VEGF及αvβ3水平作為檢驗(yàn)變量，以DR作為狀態(tài)變量，繪制ROC曲線，得出最佳臨界值，臨界值的確定以約登指數(shù)(即為靈敏度+特異度-1)為最大標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng) VEGF大于預(yù)測(cè)界值 24.22 pg/mL時(shí)，ROC曲線下面積為0.60(95%CI0.503～0.696)，預(yù)測(cè)DR的靈敏度為59.1%，特異度為69.2%，預(yù)測(cè)價(jià)值最大。見(jiàn)圖1。當(dāng)αvβ3大于預(yù)測(cè)界值 5.19 ng/mL時(shí)，ROC曲線下面積為0.671(95%CI0.571～0.771)，預(yù)測(cè)DR的靈敏度為100%，特異度為38.5%，預(yù)測(cè)價(jià)值最大。見(jiàn)圖2。

圖1 VEGF預(yù)測(cè)DR的ROC曲線 圖2 αvβ3預(yù)測(cè)DR的ROC曲線

3 討論

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界3 700萬(wàn)失明病例中，4.8%由DR引起[7]。研究發(fā)現(xiàn)，DR患者普遍存在25(OH)D3缺乏現(xiàn)狀，維生素D與DR的關(guān)系逐漸引起相關(guān)學(xué)者高度重視。維生素D由類固醇衍生而來(lái)，維生素D在肝臟中由細(xì)胞色素P450酶CYP2R1和CYP27A1羥基化為25-羥基維生素D3[25(OH)D3]，隨后在腎臟中由1-α-羥化酶(CYP27B1)介導(dǎo)下轉(zhuǎn)化為活性代謝物1，25-二羥基維生素D3(1，25(OH)2D3)。當(dāng)1，25(OH)2D3充分可用時(shí)，在腎中形成24，25-二羥基維生素D[24，25(OH)2D]，進(jìn)一步分解代謝。腎臟產(chǎn)生的1，25(OH)2D3被分泌到循環(huán)中，與維生素D結(jié)合蛋白(VDBP)結(jié)合，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到靶器官，通過(guò)與維生素D受體(VDR)的相互作用誘導(dǎo)基因組和非基因組反應(yīng)[8]。

研究顯示，維生素D缺乏是DR的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，25(OH)D3水平低于15.57 μg/L者，其DR發(fā)生率是正常人的2倍[9]，約70%的T2DM 患者血清25(OH)D3水平低于20 ng/mL[10]。本研究Logistic回歸分析同樣顯示，血清25(OH)D3是發(fā)生DR的保護(hù)因素。維生素D在T2DM方面具有多種作用，包括增加胰島素的敏感性、抗氧化應(yīng)激以及抗纖維化的特性、免疫調(diào)節(jié)作用，維生素D可通過(guò)其抗炎和抗血管生成的特性來(lái)減慢DR的發(fā)展，另外維生素D受體的遺傳變異、基因多態(tài)性也與DR有關(guān)[11-12]。

血管的生成需要血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)、EC與EC間及EC與其他周圍支持細(xì)胞間的相互作用[13]。細(xì)胞間相互作用是細(xì)胞黏附因子完成的，整合素(Integrin)在細(xì)胞遷移和黏附過(guò)程中促進(jìn)細(xì)胞與ECM蛋白的結(jié)合，接收來(lái)自ECM的剌激/抑制信號(hào)[14]，在細(xì)胞膜上廣譜表達(dá)，整合素αvβ3 作為整合素家族一個(gè)重要成員[15]，通過(guò)其內(nèi)部特異性結(jié)合區(qū)域調(diào)節(jié)細(xì)胞和胞外基質(zhì)、細(xì)胞黏附、傳遞細(xì)胞信號(hào)等功能。其作為多種細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)配體的受體，通過(guò)降解ECM、促進(jìn)血管生成、成熟和穩(wěn)定。ECM 的降解過(guò)程主要依靠基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一類含有鋅離子的蛋白水解酶，在病理狀態(tài)下，MMPs的過(guò)度活性導(dǎo)致生長(zhǎng)因子及整合素的表達(dá)上調(diào)和必要的ECM成分的降解，最終干擾內(nèi)皮細(xì)胞的組織功能[16]，MITRA等[17]研究進(jìn)一步指出，整合素活化 MMP的分子信號(hào)途徑可能是通過(guò)局部粘著斑激酶(FAK)/胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/磷脂酰肌醇-3 激酶途徑的磷酸化，激活 MMP降解基質(zhì)。維生素D能通過(guò)抑制JNK和NF-κB這兩種信號(hào)級(jí)聯(lián)的機(jī)制來(lái)抑制MMP-9(MMPs 家族成員)基因的表達(dá)，抑制MMP過(guò)度活性在體內(nèi)外的表達(dá)[18]，從而減少整合素αvβ3表達(dá)，減少血管生成。

本研究中，血清25(OH)D3水平與VEGF水平和整合素αvβ3 均呈負(fù)相關(guān)，且VEGF水平與αvβ3呈正相關(guān)(均P<0.05)。由此證實(shí)我們的推測(cè)，維生素D通過(guò)抑制整合素αvβ3 的黏附作用，減少VEGF的表達(dá)，減少對(duì)血管增殖損傷，降低視網(wǎng)膜組織破壞程度。本次關(guān)于VEGF及αvβ3預(yù)測(cè)DR的ROC曲線提示，當(dāng) VEGF及αvβ3分布大于預(yù)測(cè)界值 24.22 pg/mL和5.19 ng/mL時(shí)，ROC曲線下面積分布為0.60、0.671，預(yù)測(cè)價(jià)值最大。ROC曲線下面積在0.5～ 0.7時(shí)，表示準(zhǔn)確性相對(duì)較低，說(shuō)明VEGF及αvβ3水平對(duì)DR有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，同時(shí)也會(huì)有一定的漏診率和誤診率，所以單獨(dú)依靠VEGF及αvβ3水平預(yù)測(cè)DR的準(zhǔn)確性偏低。

目前，主要使用VEGF抑制劑治療DR新生血管形成，鑒于整合素直接參與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、遷移和增生等新生血管形成的核心環(huán)節(jié)，整合素拮抗對(duì)DR來(lái)說(shuō)可能較VEGF拮抗更為有效。因此，我們大膽猜測(cè)，通過(guò)長(zhǎng)遠(yuǎn)使用維生素D可以同時(shí)減少整合素及VEGF表達(dá)，可以同時(shí)從上游和下游阻斷新生血管形成，起到更好的治療效果。

此外，本研究結(jié)果顯示，與NDR組比較，DR組BMI、SBP、FPG、TG水平明顯增高，表明BMI、血壓、空腹血糖、血脂與DR 的發(fā)生具有相關(guān)性，Logistic回歸分析顯示糖尿病病程、SBP、BMI是DR發(fā)生的危險(xiǎn)因素。這種相關(guān)性產(chǎn)生的原因是長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)可能增加血管損傷的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜病變和其他并發(fā)癥[19]。因此，臨床治療中關(guān)注高危人群血糖、血壓、血脂的篩查、管理、達(dá)標(biāo)治療，能夠減少DR的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[20]。

維生素D的合成受季節(jié)、緯度、紫外線暴露量、VDR基因變異等多種因素的影響，本研究選取的為省內(nèi)居住人群，海拔近似相同，可粗略認(rèn)為所納入人群的光照時(shí)間近似相同，但仍存在局部地域性差異。另外本研究為回顧性研究，沒(méi)有對(duì)DR患者進(jìn)行維生素D補(bǔ)充試驗(yàn)，缺少后期隨訪資料。因此，需要DR的大型隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)研究，以準(zhǔn)確評(píng)估這些低成本干預(yù)措施在未來(lái)的潛在效益。再者，眼內(nèi)因子種類繁多，相互作用機(jī)制復(fù)雜，尚需要更多相關(guān)研究進(jìn)一步探測(cè)其機(jī)制。