抗人載脂蛋白6單鏈抗體的篩選、制備及活性鑒定①

陳 炯 詹 飛 馮 巍

(河南科技大學法醫(yī)學院，洛陽 471023)

人類載脂蛋白6 (human lipocalin 6，hLCN6) 是新發(fā)現(xiàn)的一類附睪特異性表達并分泌的載脂家族蛋白，能與精子頭部和尾部結合，與精子成熟有關[1]。本實驗室曾構建了抗hLCN6雜交瘤細胞株1B2，分泌鼠源單克隆抗體具有較高的組織特異性與靈敏度[2]，可用于精子的免疫熒光檢測。目前，hLCN6單克隆抗體 (hLCN6 mAb) 偶聯(lián)的免疫磁珠可有效用于混合細胞中精子的分離與法醫(yī)學鑒定[3]。與傳統(tǒng)單抗相比，小分子重組抗體因分子量小、易于進行基因工程操作而備受重視[4-6]，包括單鏈抗體 (scFv)、雙價單鏈抗體 (bsFv) 和嵌合抗體Fab片段，既保留了親本抗體所具有的高親和力和特異性，又簡單經(jīng)濟且易于改造，是基于抗原-抗體相互作用分離精子的理想材料。本研究通過構建抗hLCN6全套鼠源scFv噬菌體抗體文庫，篩選親和力和特異性較好的抗hLCN6 scFv,并進行原核表達純化和鑒定,為后期規(guī)?；苽湓摽贵w偶聯(lián)的免疫磁珠、法醫(yī)混合斑中精細胞的分離奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1材料 按照知情同意原則，實驗用精液樣本及女性口腔上皮細胞樣本，分別由本實驗室健康成年男性和女性志愿者提供。BALB/c小鼠購自中科院上海實驗動物中心；大腸桿菌Escherichiacoli(E.coli)Rosetta(DE3)、pET-28a質粒、hLCN6抗原及小鼠抗hLCN6 mAb 1B2由本室保存或制備；噬菌體載體pFAB5C購自Biovector公司；E.coliXL1-Blue和輔助噬菌體M13KO7購自美國Stratagene公司；Triziol試劑和反轉錄試劑盒購自Invitrogen公司；膜蛋白提取試劑盒購自美國Biovision公司；Sulfo-NHS-LC-Biotin、DynabeadsTMM-280 Streptavidin和HRP-Streptavidin試劑盒購自Thermo Fisher公司；鼠抗噬菌體M13抗體、HRP-羊抗鼠IgG、BCA蛋白定量試劑盒和增強型化學發(fā)光底物 (ECL) 購自Pierce公司；……