HSPA12B對Aβ1-42誘導PC12細胞tau蛋白磷酸化的影響①

王 萍

(紹興市人民醫(yī)院，紹興 312000)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種以老年斑和神經(jīng)纖維纏結為主要病理特征的神經(jīng)退行性疾病[1]。淀粉樣β蛋白(amyloid β-protein，Aβ)的聚集誘導神經(jīng)毒性、tau蛋白磷酸化和神經(jīng)元凋亡[2,3]。因此，任何一種能降低Aβ誘導tau磷酸化的蛋白，都可能成為治療和預防AD的新靶點。熱休克蛋白A12B (heat shock protein A12B,HSPA12B)是HSP70家族的新成員[4]。HSPA12B在腦中高表達，與腦的發(fā)育過程密切相關[5]。研究報道，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)應激過程中，HSPA12B發(fā)揮保護作用，可抑制缺血性腦損傷引起的神經(jīng)元凋亡，改善缺血引起的神經(jīng)功能障礙，維持血腦屏障通透性，敲除HSPA12B可顯著上調(diào)神經(jīng)元中活化的caspase-3表達，促進神經(jīng)元的凋亡[6-8]。AD病程中神經(jīng)元的凋亡主要通過激活caspase-3途徑，caspase-3能直接和特異地調(diào)節(jié)tau蛋白磷酸化[9,10]。本實驗選用Aβ1-42誘導PC12細胞，模擬AD病程中神經(jīng)元損傷模型，觀察HSPA12B對AD的重要病理改變tau蛋白磷酸化的影響，以期為AD的預防治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料 PC12細胞購自American Type Culture Collection；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;胰蛋白酶購自美國HyClone公司；Aβ1-42購自上海圣翔生物科技有限公司；Lipofectamine3000、OptiMEM 購自美國Invitrogen公司； HSPA12B多克隆抗體(美國Sigma 公司，HPA13659-100UL,R04942)；phosphor-Tau (pS396，p-tau，32275,F2807)； total-Tau (t-tau，sc-58860,L2315)購自美國Santa cruz公司；β-actin(杭州達文生物有限公司，DW9562,1508)。大鼠HSPA12B和陰性對照siRNA(NC)的siRNAs購自廣州銳博。CLAS100型細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；電泳儀、蛋白印跡檢測系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細胞分組培養(yǎng) PC12細胞加入DMEM培養(yǎng)基(含100 U/ml青毒素、10 μg/ml鏈霉素、10 mmol L-谷氨酰胺及10%小牛血清)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞達到80%融合時換成無血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜后進行實驗。將處于對數(shù)生長期的PC12細胞隨機分為4組：空白對照組、DMSO對照組、Aβ單一刺激組(取Aβ1-42終濃度為20 μmol/L刺激后繼續(xù)培養(yǎng)12 h)、Aβ刺激HSPA12B-siRNA組。……