血管內皮生長因子基因多態性與子宮內膜異位癥的相關性

谷杭芝，張徐，王光演，林蓉蓉，胡燕

（溫州醫科大學附屬第一醫院婦科，浙江溫州325015）

子宮內膜異位癥（簡稱內異癥）是一種婦科的常見疾病，是以宮腔以外部位（卵巢、大網膜、子宮直腸陷凹、腹壁、肺等）的活性子宮內膜細胞增殖、浸潤為特點，在育齡期婦女的發病率為5%～10%，可引起頑固性、進展性、慢性盆腔疼痛，可導致不孕、月經異常，甚至有惡變的風險，嚴重影響育齡婦女的身心健康[1]。血管內皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）是內皮細胞的特異性絲裂原，是目前已知的作用最強的促血管生成因子之一，在血管生成過程中有十分重要的作用，同時也是一種有效的血管通透性誘導因子[2]。有研究表明VEGF的高表達與內異癥的發生發展相關[3]，證明在內異癥的發病過程中VEGF是一個重要的因子。對于VEGF基因多態性與內異癥易感的關系，國外已有較多關于VEGF+405G/C、-460C/T、-634G/C、+936C/T、-1154G/A、-2578C/A等位點與內異癥的相關研究已見報道[4-8]。而VEGF的rs3025040C/T、rs10434G/A兩位點與內異癥相關的研究卻尚未見報道。本研究采用聚合酶鏈反應-限制性片斷長度多態性（polymorphismchainreactionandrestrictionfragmentlengthpolymorphismanalysis，PCR-RFLP）分析技術對溫州地區內異癥患者和非內異癥婦女的VEGF-rs3025040C/T、rs10434G/A位點基因多態性進行檢測，以探討VEGF基因多態性與內異癥遺傳易感性的關系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2014年3月至2015年3月在溫州醫科大學附屬第一醫院婦科接受腹腔鏡手術的患者150例，術后標本均經過病理學證實為內異癥，列為內異癥組。嚴格按照美國生育學會1985年修訂的內異癥分期標準（r-AFS）將所有內異癥組患者進行分期，其中I-II期內異癥患者50 例，III-IV期患者100例。隨機選取同時期本院健康體檢者150例為對照組，通過詢問既往史結合相關化驗檢查后排除內異癥。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 試劑與儀器 血液基因組DNA提取試劑盒、2×TaqPCRMasterMix、50bpDNAladder、100bpDNAladder、DNAloadingbuffer購自天根生化科技（北京）有限公司，限制性內切酶AluI、HaeIII、HpaII購自NEB（北京）有限公司，紫外分光光度計購自美國Thermo公司，電泳儀購自北京百晶生物技術有限公司，PCR擴增儀購自德國MastercyclergradientEppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提?。簾o菌操作下采集外周靜脈血至少5mL，加入內置有0.85mL枸櫞酸鈉的試管中，混勻，放置于4℃冰箱保存備用（1周內檢測）。按照血液基因組DNA提取試劑盒說明書操作提取基因組NDA。

1.3.2 基因多態性檢測：基因檢測采用PCR-RFLP技術。PCR反應體積為20μL體系，其中模板1μg，上游引物1μL，下游引物1μL，2×TaqPCRMasterMix10μL，雙蒸水補足至20μL。酶切體系為：PCR擴增產物2.5μL、10×Buffer1μL、三蒸水6.3μL、限制性內切酶0.2μL，恒溫水浴4h。將酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳，電腦成像系統成像分析。各位點引物序列、限制性內切酶及其酶切產物長度見表1-2。

表1 VEGF基因位點多態序列

表2 各位點特異引物及限制性內切酶

1.4 統計學處理方法 采用SPSS19.0 統計軟件，組間的基因型及等位基因比較采用χ2檢驗。等位基因的相對危險度用OR值和95%CI表示。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對照組Hardy-Weinberg平衡檢驗 應用Hardy- Weinberg公式計算出對照組中VEGF-rs3025040和VEGF-rs10434基因型頻率觀察數與期望數，兩者間差異無統計學意義（P＞0.05），表明本研究對照組資料具有群體代表性（見表3）。

表3 Hardy-Weinberg平衡檢驗

2.2 2組VEGF-rs3025040C/T位點多態性等位基因和基因型分布及比較 內異癥組VEGF-rs3025040C/T位點等位基因C頻率顯著高于對照組，差異有統計學意義（χ2=23.762，P ＜0.001，OR=1.800，95%CI=1.410～2.298），提示在VEGF-rs3025040C/T位點上攜帶有C等位基因的婦女患有內異癥風險是攜帶T等位基因婦女的1.800倍。內異癥組VEGFrs3025040C/T位點多態性存在CC、CT、TT3種基因型，2組基因型分布比較結果顯示，在不同基因型分布上2組差異有統計學意義（χ2=43.509，P＜0.001）。見表4。

2.3 2組VEG-rs10434G/A位點多態性等位基因和基因型分布及比較 2組VEGF-rs10434G/A位點等位基因分布差異有統計學意義（χ2=34.084，P＜0.001，OR=1.340，95%CI=1.207～1.497），提示在VEGF-rs10434G/A位點上攜帶有A等位基因的婦女更易得內異癥。VEGF-rs10434G/A位點多態性存在GG、GA、AA3種基因型，2組基因型比較差異有統計學意義（χ2=57.550，P＜0.001）。見表4。

表4 VEGF-rs3025040C/T位點和VEGF-rs10434G/A位點基因型和等位基因分布[每組n=150，頻數（%）]

3 討論

VEGF是FERRARA等[2]在牛垂體濾泡星狀細胞培養液中得到的一種寡二聚體糖蛋白，相對分子質量為35～45kDa。VEGF是內皮細胞的特異性絲裂原，是目前已知的作用最強的促血管生成因子之一，同時也是一種有效的血管通透性誘導因子[9]。目前已有的研究表明在內異癥的發病過程中VEGF是一個重要的因子[10]。子宮內膜脫落的內膜碎片可能具有先天血管生成潛能。人的子宮內膜由功能層和基底層組成，是唯一一個在卵巢類固醇激素-雌激素和孕激素調節下隨著月經周期而發生周期性的增殖、分化、退化的器官。在每個月經周期隨著內膜的生長，內膜血管系統在卵巢類固醇激素，尤其是雌激素的作用下經歷著增殖和退化的變化。SHIFREN等[11]檢測了增殖期和分泌期功能層的VEGFmRNA增加程度，表明在每個月經周期都有血管新生的發生。他進一步發現，雌激素能刺激VEGF的表達，與對照組相比，加了雌激素后VEGFmRNA的水平顯著升高。從理論上說內異癥是由內膜碎片在腹腔種植而成的。健康的內膜在雌激素的調節下展現出了先天的血管生成潛能，并且在同一實驗中證實了VEGF的異常表達和雌激素水平的異常會促進內異病灶的新生血管生成。事實上，VEGF在促進內異癥的血管新生過程中起到了重要的作用。它是一種血管活性物質，在很多的生理過程包括創口愈合和內膜的血管重建中調節內皮細胞的增殖和遷移。在腫瘤的發生過程中，VEGF濃度與血管密度增加顯著相關。在正常的內膜中，VEGF的mRNA和蛋白表達水平可被缺氧所驅動[3]。與早期內異癥患者和健康人相比，晚期內異癥患者的腹腔液中具有更高濃度的VEGF[12]。另外，內異癥患者腹腔液和血漿中升高的VEGF濃度與內異癥病灶細胞的增殖活性和微血管密度呈正相關[13]。內異癥病灶和腹腔巨噬細胞在雌孕激素的作用下會增加VEGF的表達[14-15]，成為VEGF的來源。此外，不同類型的免疫細胞通過產生促炎性和血管生成細胞因子，同時又增加其在內異癥病灶暴露的腹腔液中的濃度來參與血管形成[15]。LIN等[16]發現內異癥病灶的血管形成發生在分泌VEGF的中性粒細胞和巨噬細胞向病灶和腹腔浸潤之后，闡明了免疫細胞的重要性，人類的子宮內膜功能層具有獨特的在周期性脫落后出現周期性的增殖和退化的變化，因此子宮內膜碎片進入腹腔后仍具有血管生成能力。

人的VEGF基因位于染色體的6p21.3，長14kb，由8 個外顯子和7 個內含子交替組成。VEGF基因至少有30 個單核苷酸多態性位點，如+405G/C、-460C/T、-634G/C、+936C/T、-1154G/A、-2578C/A等。這些基因多態性可能通過影響VEGF的轉錄或表達而影響腫瘤的發生、發展和預后。對于VEGF基因多態性與內異癥易感的關系國外有較多報道。ALTINKAYA等[5]研究表明+405G/CG等位基因的存在與內異癥的發病有關。有研究[17-18]指出，VEGF-460C/T和+405G/C多態存在連鎖不平衡，-460T/+405C單倍型與低啟動子活性有關，攜帶+405G等位基因可能增加內異癥的發病風險；KIM等[8]報道韓國婦女攜帶CC基因型的罹患風險增加1.99倍；早期IKUHASHI等[7]研究發現VEGF+936C/T的T等位基因可能增加III-IV期內異癥的患病風險，HENIDI等[6]也得到了相似的結果。而林蓉蓉等[19]研究發現MIF基因多態性與腹壁內異癥遺傳易感性相關，提示我們基因多態性與內異癥的發生相關。劉青等[20]研究發現攜帶VEGF-1154GG和-2578CC基因型顯著增加內異癥的發病風險，而其中單倍型VEGF-460/-1154/-2578TGC、CAA、TAA和TAC與內異癥的發病明顯相關。VEGF+936C/T基因多態性可能與內異癥的發生發展有關，C等位基因可能是內異癥的易感基因[21]。

而在本研究中新納入的2 個VEGF多態性位點rs3025040C/T和rs10434G/A在內異癥發病中均具有顯著性意義，rs3025040C/T的C等位基因和rs10434G/A位點的A等位基因均增加內異癥的罹患風險，為預測婦女內異癥的發病風險，篩選出高風險的婦女，盡可能降低發病風險，或積極干預減輕病情進展奠定實驗基礎。但VEGFrs3025040C/T的C等位基因和rs10434G/A位點的A等位基因，如何調控內異癥的發生發展，有待進一步研究證實。