羥苯磺酸鈣對動脈粥樣硬化斑塊形成的影響及其機制

王瑩，李彩，朱峰，金笑平

（臺州醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江臺州317000）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是多數(shù)心腦血管疾病的共同病理基礎(chǔ)，主要表現(xiàn)為動脈壁內(nèi)大量脂質(zhì)和纖維組織蓄積并伴有局部炎性反應(yīng)，嚴(yán)重威脅患者的心身健康[1]。AS早期即表現(xiàn)為內(nèi)皮功能障礙，調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能可有效防治AS導(dǎo)致的心腦血管疾病。羥苯磺酸鈣作為一種血管保護(hù)劑，可以改善局部血液循環(huán)，已廣泛應(yīng)用于治療糖尿病相關(guān)并發(fā)癥和腎功能不全相關(guān)疾病，而其對AS斑塊形成影響的研究較少[2]。本研究旨在以液氮凍傷術(shù)建立兔AS斑塊模型，并給予羥苯磺酸鈣干預(yù)，以探討羥苯磺酸鈣對AS斑塊形成的影響及其可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料 SPF級健康雄性新西蘭兔24只，兔齡為3～4個月，體質(zhì)量1.9～2.2kg，購自溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[動物許可證號：SCXK（浙）2015-0001]。羥苯磺酸鈣由西安利君制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號0706057。內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）、一氧化氮（nitricox-ide，NO）和血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothe-lialgrowthfactor，VEGF）ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所，基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrixmetalloproteinase-9，MMP-9）和纖溶酶原激活物抑制劑-1（plasminogenactivatorinhibitor-1，PAI-1）及SP超敏試劑盒購自上海天呈科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 兔AS斑塊模型的建立：所有動物適應(yīng)性喂養(yǎng)3d，以液氮凍傷術(shù)建立AS斑塊模型，模型的制作參照FANG等[3]的方法，即以3%戊巴比妥鈉（30mg/kg）進(jìn)行全身麻醉，分離右頸總動脈，血管兩端以動脈夾阻斷血流，以0.9%氯化鈉溶液沖洗后抽空血管腔，再以1mL注射器抽取液氮，快速注入血管腔，反復(fù)3次以造成血管內(nèi)皮損傷。放開動脈夾恢復(fù)血流，縫合肌肉組織及皮膚，常規(guī)使用抗生素預(yù)防感染。實驗程序遵循動物保護(hù)和應(yīng)用條例。

1.2.2 分組與處理：造模后將兔隨機分為治療組和模型組，每組各12只。治療組于造模當(dāng)天開始給予羥苯磺酸鈣（0.15mg/g/d）+高脂飼料（含1%膽固醇、3%大油、15%蛋黃和81%普通飼料）喂養(yǎng)，模型組僅給予高脂飼料喂養(yǎng)，連續(xù)8周。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 組織病理學(xué)檢查：8周后處死兔，取出右頸總動脈2～3cm，一部分以4%多聚甲醛固定24h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制備4μm厚連續(xù)石蠟切片，作HE染色和彈力纖維染色，光鏡觀察AS斑塊病理形態(tài)；另一部分以3%戊二醛溶液固定，超薄組織切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙染色，JEM-1230透射電鏡觀察AS斑塊病理形態(tài)。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色：取上述右頸總動脈石蠟切片，采用SP法測定斑塊中MMP-9和PAI-1蛋白表達(dá)，DAB顯色，棕黃色顆粒狀產(chǎn)物為陽性標(biāo)記。具體步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。采用LeicaQWINV3圖像分析系統(tǒng)對免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行分析，每張玻片標(biāo)本均隨機選取8個視野，以平均灰度值表示檢測的右頸總動脈各層染色陽性面積。

1.3.3 ELISA檢測：治療前及治療8周后分別抽取各組兔耳緣靜脈血2mL，離心分離血清，ELISA法檢測血清ET-1、NO及VEGF含量。具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計量資料以表示，組間比較采用兩樣本t 檢驗，組內(nèi)比較采用配對t 檢驗。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果

2.1.1 HE染色：治療組右頸總動脈可見內(nèi)膜、中膜增厚，平滑肌增殖并向內(nèi)膜遷移，血管腔內(nèi)可見一層不規(guī)則的較薄斑塊，內(nèi)含泡沫細(xì)胞和炎性細(xì)胞（見圖1A）。模型組右頸總動脈內(nèi)膜、中膜增厚明顯，血管腔內(nèi)可見半球形脂質(zhì)斑塊顯著隆起，斑塊表面有纖維組織覆蓋，形成典型的“纖維帽”，內(nèi)含大量泡沫細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤（見圖1B）。

圖1 治療8周后兔右頸總動脈斑塊形成情況（HE染色，×200）

2.1.2 彈力纖維染色：治療組右頸總動脈彈力纖維和膠原纖維形態(tài)不規(guī)則，排列稍紊亂，膠原纖維增多，藍(lán)黑色的內(nèi)彈力板以內(nèi)可見較薄脂質(zhì)斑塊（見圖2A）。模型組右頸總動脈彈力纖維和膠原纖維排列紊亂，藍(lán)黑色的內(nèi)彈力板以內(nèi)有斷裂現(xiàn)象，可見突向血管腔的較大脂質(zhì)斑塊（見圖2B）。

2.1.3 透射電鏡：治療組右頸總動脈中層平滑肌細(xì)胞梭形，排列稍紊亂，間質(zhì)增寬，結(jié)締組織增生，胞質(zhì)內(nèi)見微絲及密體密斑，內(nèi)膜及中膜可見少量脂滴（見圖3A）。模型組右頸總動脈內(nèi)膜呈斑塊狀增生，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，內(nèi)彈力膜增厚變性，中層平滑肌細(xì)胞排列紊亂，間質(zhì)增寬，中膜結(jié)締組織增生，內(nèi)膜及中膜可見大量脂滴，高度空泡變性（見圖3B）。

圖2 治療8周后兔右頸總動脈內(nèi)膜病變情況（彈力纖維染色，×200）

圖3 治療8周后兔右頸總動脈斑塊處透射電鏡表現(xiàn)

2.2 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果 8周后，抗MMP-9、PAI-1染色發(fā)現(xiàn)，MMP-9、PAI-1陽性染色為棕褐色，治療組可見右頸動脈斑塊處MMP-9、PAI-1呈散在弱陽性表達(dá)，而其在模型組則表達(dá)明顯增高，呈強陽性表達(dá)。治療組MMP-9、PAI-1在上述部位的表達(dá)量較模型組明顯減少（P均＜0．05）。見圖4-5和表1。

圖4 治療8周后兔右頸總動脈斑塊處MMP-9表達(dá)情況（DAB染色，×200）

圖5 治療8周后兔右頸總動脈斑塊處PAI-1表達(dá)情況（DAB染色，×200）

表1 2組兔右頸總動脈MMP-9和PAI-1免疫組織化學(xué)灰度值比較（每組n=12

表1 2組兔右頸總動脈MMP-9和PAI-1免疫組織化學(xué)灰度值比較（每組n=12

與模型組比：aP ＜0.05

組別 MMP-9 PAI-1模型組 136.97±7.81 145.02±10.26治療組 118.08±14.36a 126.15±8.65a

2.3 ELISA檢測結(jié)果 治療前兩組血清ET-1、NO及VEGF表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療8周后，2組ET-1水平均顯著降低，NO、VEGF水平均顯著升高，且治療組血清ET-1水平低于模型組，NO、VEGF水平高于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 2組血清ET-1、NO及VEGF水平比較（每組n=12

表2 2組血清ET-1、NO及VEGF水平比較（每組n=12

與組內(nèi)治療前比：aP ＜0.05；與模型組治療后比：bP ＜0.05

組別 ET-1（ng/L） NO（μmol/L） VEGF（pg/mL）治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后模型組 103.32±15.45 90.81±12.10a 21.23±5.54 26.26±4.35a 22.12±3.90 27.21±4.92治療組 101.95±16.07 76.32±10.01ab 20.95±3.72 31.47±4.09ab 21.83±3.72 32.58±5.46ab

3 討論

目前，有關(guān)AS斑塊形成機制的學(xué)說主要有：內(nèi)皮損傷學(xué)說、脂質(zhì)浸潤學(xué)說、慢性炎癥學(xué)說、平滑肌細(xì)胞增生學(xué)說、血栓源學(xué)說等[4-5]，其中血管內(nèi)皮損傷和脂質(zhì)浸潤被認(rèn)為是導(dǎo)致AS的始動因素[6]。

AS疾病普遍存在內(nèi)皮功能障礙[7]。研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞可通過釋放血管活性物質(zhì)如NO和ET-1等調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能[8]。NO是由NO合酶催化左旋精氨酸氧化生成，它不僅參與介導(dǎo)血管舒張，使平滑肌松弛，對血管有一定的保護(hù)作用，還能阻止血小板的聚集和黏附，具有顯著的抗血栓形成作用。ET-1則正好相反，可以引起血管收縮，激活巨噬細(xì)胞，引起血小板聚集，損害血管內(nèi)皮，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，促使AS的形成[9]。病理狀態(tài)下，血管內(nèi)皮功能出現(xiàn)紊亂，NO降低，并促進(jìn)ET-1分泌，造成血管痙攣，誘導(dǎo)AS形成[10]。我們可以通過調(diào)節(jié)NO和ET平衡，維持血管內(nèi)皮功能正常及結(jié)構(gòu)完整，從起始環(huán)節(jié)干預(yù)AS斑塊形成[11]。此外，VEGF可通過促進(jìn)NO合成酶的生成，進(jìn)而促進(jìn)NO的生成，與NO共同作用發(fā)揮舒張血管的作用，促進(jìn)新生血管的穩(wěn)定和成熟，避免血栓形成，減輕AS發(fā)病程度[12]。由于VEGF在正常血管中基本無表達(dá)，而在AS斑塊中表達(dá)顯著增加，它能特異性地促進(jìn)血管內(nèi)皮修復(fù)與新生血管形成，促進(jìn)AS斑塊的形成，所以，VEGF在加速AS斑塊形成過程中也具有重要作用。

目前研究認(rèn)為，AS的發(fā)展過程與細(xì)胞外基質(zhì)的降解、平滑肌細(xì)胞遷移和基質(zhì)再生等密切相關(guān)[13]。MMP-9作為基質(zhì)金屬蛋白酶類中相對分子質(zhì)量最大的酶，是降解IV、V型膠原最主要成員之一。膠原纖維的降解降低了內(nèi)皮細(xì)胞基底膜的完整性，促使中膜平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜遷移，在AS病變及斑塊的破裂中發(fā)揮最關(guān)鍵性的作用[14]。PAI-1是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，在正常血管內(nèi)皮細(xì)胞中合成。PAI-1可能通過影響血管內(nèi)皮再生、平滑肌細(xì)胞遷移、動脈附壁血栓形成等環(huán)節(jié)參與AS的形成。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷時，血漿PAI-1等纖溶因子水平異常，啟動和加速AS的發(fā)生發(fā)展[15]。

羥苯磺酸鈣作為血管保護(hù)劑，已廣泛應(yīng)用于糖尿病腎病、慢性靜脈功能不全、冠心病等的治療[16-17]。研究證實[18]，羥苯磺酸鈣能通過減少內(nèi)皮細(xì)胞中山梨醇的形成，減輕血管內(nèi)皮的損傷，抑制血管活性物質(zhì)及血小板的活化和聚集，降低毛細(xì)血管的通透性和脆性，從而對血管發(fā)揮一定的保護(hù)作用。

在本研究中，我們通過液氮凍傷術(shù)結(jié)合高脂飲食建立兔AS斑塊模型，再以羥苯磺酸鈣干預(yù)模型兔，結(jié)果表明，羥苯磺酸鈣不僅能降低血循環(huán)中ET-1含量，升高NO、VEGF水平，還能減少血管壁局部組織中PAI-1和MMP-9蛋白的表達(dá)，說明羥苯磺酸鈣可能從保護(hù)血管內(nèi)皮、延緩動脈硬化及穩(wěn)定粥樣斑塊等方面保護(hù)大血管。因此，羥苯磺酸鈣能明顯改善AS斑塊形成的可能機制是減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的密度，減少微血栓形成，進(jìn)而阻止AS斑塊的發(fā)生發(fā)展。