miRNA-244與miRNA-328在膽管癌患者血清中的表達及意義*

楊自華，郭平學，王西輝，吳 娟，張峰偉

西安醫學院第二附屬醫院（西安710038）

膽管癌是一類起源于肝內或肝外膽管上皮細胞的惡性腫瘤，其發病率占肝膽腫瘤總發病率的10%～15%。膽管癌惡性程度高，易發生轉移，尤其易向肝動脈或門靜脈侵襲［1］。由于診斷困難和手術治療預后較差的原因，近年來膽管癌的發病率和病死率呈逐年上升的趨勢，嚴重威脅著患者的生命［2］。目前，根治性切除手術是膽管癌患者得到治愈或長期生存的唯一手段［3］。由于膽管癌在發病初期并無明顯癥狀，大多初診患者已失去根治性手術治療的機會。因此，有效診斷和評估膽管癌發生發展的生物學指標顯得尤為重要［4］。微小RNA（MicroRNA，miRNA）是一條具有20～25個核苷酸序列的內源性非編碼RNA，可與特定m RNA 結合，抑制蛋白質翻譯過程，從而產生相應的生物學效應［5］。miRNA 具有進化保守的特性，在腫瘤的發生過程中起重要作用。現有的研究顯示，某些miRNA 在腫瘤組織的細胞增殖、細胞凋亡、分化、血管生成、遷移、代謝和侵襲過程中發揮關鍵作用［6］。miRNA-244與miRNA-328 在腫瘤患者中的表達有變化，而關于miRNA-244與miRNA-328在膽管癌患者中的研究尚無報道。本研究通過檢測miRNA-244和miRNA-328在膽管癌患者血清中的含量變化，探究miRNA-244和miRNA-328 在膽管癌發生發展中發揮的病理生理學作用。

對象和方法

1 研究對象 本研究經西安醫學院第二附屬醫院倫理委員會批準后進行，所有患者均簽署知情同意書。選取2017年1月至2018年12月在西安醫學院第二附屬醫院收治的膽管癌患者52例作為研究組，其中膽管癌未轉移患者20例，膽管癌伴轉移患者32例，選取同期收治的肝良性瘤患者43例作為對照組。膽管癌未轉移患者納入標準:①年齡18～70周歲；②初次就診，入院診斷為膽管癌；③無膽管外淋巴及外周組織轉移。膽管癌伴轉移患者的納入標準:①年齡18～70周歲；②初次就診，入院診斷為膽管癌；③原發性膽管腫物或遠處轉移性病變經病理學診斷為膽管癌。根據病史排除惡性腫瘤，系統性免疫功能疾病，腎臟心臟功能不全等患者。

2 血清樣本采集 所有研究對象于入院次日清晨7～8點以常規方法采集5 ml靜脈血至無添加劑采血管中。血液樣本于常溫下放置1 h 后3000 r／min離心20 min，取上層1 ml血清至EP管中，加入1 ml Trizol試劑，于-80℃超低溫冰箱中保存。

3 主要儀器與試劑 Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，PCR 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。實時定量PCR 試劑購自寶生生物技術有限公司。實時定量PCR 儀為Bio-Red 公司產品。-80超低溫冰箱購自Thermo Fisher公司。

4 實時定量PCR 檢測血清中miRNA 的表達

通過Trizol法提取血清RNA，進行擦除DNA 和反轉錄操作，得到cDNA 用于反轉錄，按照說明書配制反轉錄體系。實時定量PCR 采用兩步法，條件如下:步驟一，預變性，95℃，30 s；步驟二，PCR 反應，95℃5 s，60℃30 s，此步驟循環40次。通過2-ΔΔCt法檢測miRNA-244和miRNA-328的表達水平。本實驗所用引物序列，見表1。

5 統計學方法 數據分析采用SPSS 17.0統計學軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，繪制miRNA-244和miRNA-328診斷膽管癌轉移的受試者工作特征曲線（ROC 曲線），計算ROC曲線下面積（AUC）、靈敏度、特異性等。P＜0.05為差異有統計學意義。T T A

表1 引物序列

結 果

1 研究對象一般資料比較 見表2。對照組、膽管癌未轉移組和膽管癌伴轉移組患者性別和年齡比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表2 研究對象一般資料比較

2 血清中miRNA-244和miRNA-328表達水平比較 qRT-PCR 結果見表3、圖1。膽管癌未轉移組患者血清miRNA-244較對照組明顯升高（P＜0.05），膽管癌轉移組患者血清miRNA-244較對照組也明顯升高（P＜0.05），說明miRNA-244可能是膽管癌促進發生、轉移的關鍵因素和預測指標；膽管癌未轉移組血清miRNA-328較對照組有降低趨勢但無統計學差異（P＞0.05），而膽管癌伴轉移組患者血清miRNA-328明顯低于對照組（P＜0.05），說明miRNA-328可能對膽管癌的發生，轉移有抑制作用并具有預測意義。

表3 各組miRNA-244和miRNA-328血清表達量比較

3 血清中miRNA-244和miRNA-328表達水平在膽管癌伴轉移患者中的診斷價值 通過繪制miRNA-244和miRNA-328在血清中表達水平的ROC曲線，分別評價兩者對膽管癌轉移的診斷效能（圖2）。血清中miRNA-244的表達水平佳界值為4.26，此時其靈敏度和特異度分別為73.0% 和60.1%，AUC 值為0.7225，（P=0.0161）；血清miRNA-328表達水平AUC值為0.5941（P=0.3346）。這些結果提示，血清miRNA-244的表達水平可以較好地區分膽管癌是否轉移。

圖1 血清中miRNA-244和miRNA-328的表達

圖2 血清miRNA-244和miRNA-328診斷膽管癌伴轉移的ROC曲線

討 論

膽管癌是指原發于左右肝管匯合部至膽總管下端的肝外膽管惡性腫瘤。近年來，由于飲食習慣和醫療技術的發展，膽管癌的發病率呈逐年上升的趨勢［7］。高齡和慢性膽道炎癥刺激是膽管癌發生的病理生理學基礎，臨床治療膽管癌常用的方法有手術治療、放療、化療等［8-9］。而現有的膽管癌早期診斷和預后判斷技術尚不成熟，難以早期發現膽管癌和有效評估預后，這導致膽管癌成為預后最兇險的惡性腫瘤之一，嚴重威脅患者的生命［10-11］。近年來的研究表明，miRNA 不但參與人體的正常生理活動，同時也與一些疾病的發生發展密切相關。有研究顯示，特定的miRNA 對食道癌、胰腺癌及肝癌等惡性腫瘤的發生具有預測作用，可作為一些腫瘤的血清標記物。本研究顯示，miRNA-244和miRNA-328在膽管癌的發生發展中血清的表達量均發生重大變化，因此有望利用miRNA-244 和miRNA-328對膽管癌的診斷和預后進行評估，有效提高患者的治愈率和生存率。

miRNA 是大約20～25個核苷酸長的單鏈RNA分子，miRNA 能夠通過結合靶基因3′-UTR 區而發揮負向調控作用。有研究顯示miRNA 在腫瘤發生和腫瘤轉移中起重要作用。在各種類別的惡性腫瘤研究顯示，因為難以從懷疑惡性腫瘤的患者獲得有用的組織活檢，miRNA 作為潛在的腫瘤診斷和預后的生物標志物越來越吸引更多研究者的目光。

在生理狀態下，miRNA-244可通過抑制卵丘細胞中的Ptx3 分子延遲卵母細胞的成熟［12］，通過下調DMRT1促進生精細胞的自我更新［13］，同時可以抑制SMAD4分子的表達抑制多種來源的間充質干細胞向骨細胞分化［14］。在循環系統中，miRNA-244 可受血管緊張素II的影響而促進心肌纖維化形成［15］。在神經系統中，miRNA-244通過抑制SPG7，抑制腦缺血后神經細胞的凋亡［16］。關于腫瘤的研究中，miRNA-244同樣扮演重要角色，miRNA-244 通過抑制m TOR 蛋白表達，激活Caspase-9／3 表達促進胃癌的生長和進展［17］；而且，miRNA-244亦可通過下調SUFU 蛋白的表達抑制膀胱癌細胞的生長和內皮向間充質干細胞的表型轉化［18］。miRNA-244的表達量在宮頸癌中被上調，參與肝細胞癌的生成，并在腫瘤的遷移、侵襲和癌細胞增殖中發揮重要作用［19］，而在胰腺癌中miRNA-244亦發揮著類似的作用［20］。

miRNA-328在生理和病理狀態下也發揮著重要的作用。研究顯示，miRNA-328通過下調TGFβRIII，激活TGFβ1 通路促進心肌間質纖維化［21］。miRNA-328同時具有修復支氣管上皮細胞的潛力［22］。而在腫瘤細胞的研究中，miRNA-328 通過抑制TCF7L2 蛋白，抑制腫瘤細胞生長和腫瘤形成［23］，通過轉錄后抑制PTPRJ蛋白促進肝癌細胞凋亡［24］，miRNA-328通過抑制CD44基因的m RNA，抑制鼻咽癌細胞的轉移和內皮-間充質干細胞表性轉化［25］。miRNA-328在白藜蘆醇治療骨肉瘤時會大量表達，通過抑制基質金屬蛋白酶2抑制腫瘤細胞的遷移。miRNA-328 也可通過抑制磷酸酶來促進細胞凋亡，發揮抗癌作用［26］。同時miRNA-328具有抑制胰腺癌腫瘤細胞增殖和代謝的功能。

本研究膽管未轉移患者和膽管癌伴轉移患者的血清，進行實時定量PCR 檢測。發現隨著膽管癌病情的發展miRNA-244的表達量逐漸升高，而miRNA-328的表達量在膽管癌轉移患者中降低。上述結果表明，miRNA-244和miRNA-328的檢測在一定程度上有利于醫生對膽管癌進行初篩。由于miRNA-244與miRNA-328均與腫瘤細胞的增殖、代謝、遷移和侵襲密切相關。通過ROC 曲線分析miRNA-244 與miRNA-328在膽管癌伴轉移患者中的診斷價值，結果發現，miRNA-244可以有效的區分膽管癌是否轉移。因此，血清中miRNA-244 和miRNA-328 水平有望成為膽管癌的可靠標志物。