MiR-123調控Bcl-2對宮頸癌細胞侵襲及轉移能力的影響*

趙 敏，趙 琳，鐘社蘭

陜西省安康市人民醫院（安康725000）

宮頸癌是女性發病率和致死率較高的腫瘤之一，在部分大中城市已成為女性發病率最高的癌癥。當前該病的主要治療方法為手術、放化療、內分泌治療等，顯著降低了宮頸癌的病死率［1］。有報道顯示Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期宮頸癌的5年生存率分別為60%左右、45%左右與15%左右［2-3］。現代研究顯示宮頸癌的產生與發展是一個多因素參與、多階段發展的復雜事件［4］。微小RNA（MiRNA，MiR）是一類廣泛存在于真核生物體內、長度大約為18～25 nt的非編碼小單鏈RNA 分子，具有表達時序性、組織特異性、高度保守性等特點，可調節細胞增殖、細胞凋亡、病毒防御、脂肪代謝等多個生物學過程［5-6］。MiR-123 普遍被認為是一種腫瘤抑制因子，可調控宮頸癌發生發展過程中的相關階段，也可能和惡性腫瘤化療耐藥性的產生有一定的相關關系［7］。B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）基因是一個原癌基因，可抑制惡性腫瘤的凋亡和壞死［8］。本文具體探討了miR-123調控Bcl-2對宮頸癌侵襲及轉移能力的影響，現報告如下。

材料與方法

1 實驗材料 宮頸癌細胞Hela購于中國醫學科學院基礎醫學研究所，培養于含有10%血清（美國Gibico公司）的DMEM 培養基（美國BD 公司）中（培養條件37℃與5%CO2）。CCK-8檢測試劑盒購自上海生工公司，青鏈霉素混合液購自國藥集團，細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD 公司，Transwell小室購自日本TAKARA 公司，抗Bcl-2抗體與抗AKT 抗體購自美國Sigma公司，hsa-MiR-123 mimics、negative control購自上海吉瑪公司。

2 研究方法

2.1 細胞轉染:將處于對數生長期的Hela細胞消化，進行細胞計數，加入12孔板，每孔加入1 ml培養基，再加入含有細胞數為1×105個的細胞懸液，孵育12 h后進行轉染。MiR-123組與對照組分別轉染hsa-MiR-123 mimics、negative control（陰性對照），轉染體積為100μl，空白組轉染等體積的磷酸鹽緩沖液。

2.2 CCK-8增殖實驗:細胞轉染后用胰酶將細胞消化，種于96孔板，每孔5×103個細胞（100μl），每組各3個復孔，細胞培養后每個孔加入10μl CCK-8檢測試劑，放入孵箱內反應2 h，然后放入酶標儀進行吸光度（A450 nm）檢測，計算細胞增殖指數。

2.3 細胞侵襲及轉移實驗:將Matrigel matrix基質膠取出融化，用無血清培養基進行稀釋，取100μl鋪于Transwell小室內，取出24 孔板，下層加入600 μl的有血清培養基。將轉染后的細胞24 h后消化處理，小室內加入1×105個細胞，轉移實驗放入的是不帶基質膠的小室，侵襲實驗放入帶基質膠的小室，然后進行常規孵育。然后加入4%的多聚甲醛固定細胞，重新加入600μl的結晶紫，晾干后觀察細胞狀況，在倒置顯微鏡下觀察并拍照，計數細胞數并計算細胞侵襲及轉移指數。

2.4 細胞凋亡實驗:細胞轉染后進行消化，1000 r／min離心5 min，用結合緩沖液使細胞重懸，并向管內加入5μl的加異硫氰酸熒光素（FITC），混勻后4℃避光放置15 min。再加入10μl的碘化丙啶（PI）溶液，混勻后4℃避光放置5 min。上流式細胞儀進行檢測，計算細胞凋亡指數。

2.5 Western blot實驗:轉染后收集并裂解細胞，提取并定量總蛋白，與上樣緩沖液混合后煮沸10 min，緩慢冷卻后上樣，轉膜后封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，洗滌3次后加入二抗，室溫孵育1 h，洗滌3次后進行成像，記錄Bcl-2、AKT 蛋白相對表達水平。

3 統計學方法 選擇SPSS 22.00統計學軟件進行分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，符合正態分布時對比采用t檢驗，若不符合正態分布則采用Mann-Whitney分析，檢驗水準為α=0.05。

結 果

1 細胞增殖指數對比 細胞轉染后24、36 h，MiR-123組的細胞增殖指數顯著低于對照組與空白組（P＜0.05），對照組與空白組對比差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 三組轉染后不同時間點細胞增殖指數對比（%）

2 細胞侵襲及轉移指數對比 細胞轉染后24、36 h，MiR-123組的細胞侵襲及轉移指數顯著低于對照組與空白組（P＜0.05），對照組與空白組對比差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 三組轉染后不同時間點細胞侵襲及轉移指數對比（%）

3 細胞凋亡指數對比 細胞轉染后24、36 h，MiR-123組的細胞凋亡指數顯著高于對照組與空白組（P＜0.05），對照組與空白組對比差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 三組轉染后不同時間點細胞凋亡指數對比（%）

4 Bcl-2蛋白表達水平對比 細胞轉染后36 h，MiR-123組的Bcl-2、AKT 蛋白相對表達水平顯著低于對照組與空白組（P＜0.05），對照組與空白組對比差異無統計學意義（P＞0.05），見表4、圖1。

表4 三組轉染后36 h Bcl-2、AKT蛋白相對表達水平對比（±s）

表4 三組轉染后36 h Bcl-2、AKT蛋白相對表達水平對比（±s）

注:與對照組對比，*P＜0.05；與空白組對比，△P＜0.05

組 別 n Bcl-AKT MiR-123組 3 0.67±0.13*△ 0.89±0.12 2*△對照組 3 2.31±0.13 2.45±0.14空白組3 2.41±0.0 2.49±0.33

圖1 三組Bcl-2、AKT 蛋白表達水平

討 論

宮頸癌是世界范圍內主要的婦科腫瘤之一，我國每年新發病例13～15 萬，年輕患者發病率呈上升趨勢。手術為該病的主要治療方法，能顯著提高患者的生存率，但是很多患者術后仍存在復發情況，嚴重影響患者的生活質量。特別是單純手術治療很難根治腫瘤復發，多需要聯合綜合治療手段。miRNA 在細胞增殖與凋亡、個體發育等生理活動中起重要調控作用，也與惡性腫瘤的發生發展、侵襲及轉移以及多藥耐藥性密切相關［9］。不過miRNA 對靶基因的調節不是簡單的對應關系，而是一種錯綜復雜的網絡關系［10］。細胞通過增殖產生新的細胞，是機體生長發育和種族延續的基礎；腫瘤細胞的侵襲及轉移是腫瘤的最重要的特點；凋亡是細胞的一種程序性的正常死亡過程，是目前抗腫瘤基因治療的重要方面［11］。本研究顯示細胞轉染后24、36 h，MiR-123組的細胞增殖指數、侵襲及轉移指數顯著低于對照組與空白組，細胞凋亡指數顯著高于對照組與空白組，對照組與空白組對比差異無統計學意義，表明高表達MiR-123 能促進細胞增殖、侵襲及轉移，抑制細胞凋亡。相關研究也顯示MiR-123可靶向PI3K 基因誘導細胞的凋亡，能夠降低腫瘤細胞的轉移，從而提高細胞的存活率［12］。

隨著我國防癌普查工作的進行及女性受教育水平的提高，宮頸癌的病死率均明顯下降，但是其發病率呈現一定的上升趨勢，且發病患者群越來越年輕化。局部宮頸癌術后復發率為30%，特別是根治性手術后復發的患者5年生存率僅為10%左右。宮頸癌發病與遺傳有顯著相關性，由于內外在致病因素誘發與宮頸癌相關基因突變，從而導致宮頸癌的形成。腫瘤細胞信號通路在機體生命過程中發揮重要作用，部分耐藥惡性腫瘤細胞的Bcl-2／AKT 信號轉導通路在耐藥細胞處于異常活躍狀［13］。Bcl-2可與細胞內含有PH 結構域的信號蛋白AKT 結合，促使AKT 蛋白的活化，激活或抑制其下游靶蛋白，進而調節細胞的轉移、增殖、分化、凋亡等［14］。Bcl-2／AKT 信號通路上相關基因的突變、錯配、擴增、轉置、DNA 異常甲基化可導致一系列的遺傳及表觀遺傳上的改變，從而誘發耐藥的產生［15］。本研究顯示細胞轉染后36 h，MiR-123 組的Bcl-2、AKT 蛋白相對表達水平顯著低于對照組與空白組，對照組與空白組對比差異無統計學意義。從機制上分析，MiR-123為一種抑癌因子，MiR-123過表達可以抑制Bcl-2／AKT 信號通路的激活，從而抑制細胞的侵襲及轉移。

總之，過表達MiR-123能抑制Bcl-2／AKT 通路的激活，從而抑制宮頸癌細胞增殖、侵襲及轉移，促進細胞凋亡，從而發揮抑癌作用。