葒草苷對APP／PS1轉基因小鼠神經保護作用實驗研究*

張 澤，韓 錕，賈 寧

錦州醫科大學附屬第一醫院神經內科（錦州121001）

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種發生于中老年的神經系統變性疾病。研究表明［1-3］，AD 患者腦源性神經生長因子（Brain derived neurotrophic factor，BDNF）及其功能性酪氨酸激酶B（Tyrosine kinase B，Trk B）受體表達減少。BDNF 屬于神經營養因子家族的成員，在神經再生的發生、發展中發揮重要作用，其作用于Trk B受體，發揮抗神經元凋亡、改善認知功能的作用。腦內大量的β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）沉積形成的老年斑是AD特征性病理改變之一，而Aβ1-42 是老年斑的主要成分［4］。葒草苷（Orientin，Ori）是一種水溶性碳苷類黃酮化合物，為葒草、竹葉、金蓮花的主要活性成分，具有抗氧化應激、抗衰老、抗炎、抗凋亡等多種神經保護作用，能夠改善癡呆小鼠的認知功能［5-7］。本文以APP／PS1轉基因小鼠為研究對象，研究Ori對此動物模型BDNF和Trk B受體的作用，以及對Aβ沉積的影響。

材料與方法

1 實驗材料 動物:10月齡APP／PS1轉基因小鼠24只，同月齡同背景C57BL／6J小鼠8 只，購自中國醫科大學實驗動物中心［許可證號:SYXK（遼）2012-007］。藥品與試劑:葒草苷（純度≥99%）購于成都曼思特生物科技有限公司；兔抗BDNF 抗體、兔抗TrkB受體抗體購于北京博奧森生物技術有限公司；Aβ1-42 ELISA 試劑盒購于Invitrogen 公司。儀器:Morris水迷宮（安徽正華生物儀器設備有限公司）；電泳儀、凝膠成像系統（美國bio-rad公司）；紫外分光光度計（德國Biophotometer）。

2 實驗方法

2.1 動物分組與處理:將APP／PS1轉基因小鼠隨機分成三組，即模型組（Tg組）、Ori低劑量組（Tg／Ori-L組）和Ori高劑量組（Tg／Ori-H 組），對照組（NT 組）為同月齡同背景C57BL／6J小鼠。每組小鼠8只，雌雄各半，體重（25±3）g，各組小鼠體重比較無統計學差異。給藥方法:NT 組和Tg組每天給予雙蒸水5 ml腹腔注射，Tg／Ori-L 組和Tg／Ori-H 組每天分別給予Ori 10、50 mg／kg 5 ml腹腔注射，均給藥4周。

2.2 Morris水迷宮實驗行為學檢測:給藥結束24 h后行Morris水迷宮實驗。實驗分為定位航行實驗和空間探索實驗兩部分。實驗程序參照Morris等方法進行［8-9］，檢測各組小鼠的空間學習記憶能力。

2.3 Western blot檢測BDNF 和Trk B 受體的蛋白表達:提取各組小鼠海馬的總蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度。40μg蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉膜，用5%牛奶封閉，加入一抗（BDNF，1∶500；Trk B 受體，1∶500；β-actin，1∶4000）4 ℃孵育過夜，再加入辣根過氧化物酶結合的二抗常溫孵育1 h。ECL 顯影，凝膠成像系統曝光，Image J軟件分析。

2.4 ELISA 法檢測海馬區Aβ1-42水平:將各組小鼠的腦組織稱重，加入8倍體積的鹽酸胍裂解液研磨，室溫下靜置3～4 h。用反應緩沖液1∶50稀釋樣品后離心20 min，取上清用于可溶性Aβ1-42的測定，離心管底部沉淀再用70%甲酸溶解后離心1 h，收集上清液用于不可溶性Aβ1-42的測定。取標準品按說明書建立標準曲線。將標準品、樣品各50μl分別加入微量酶標板內，立即向每孔加入50μl Aβ1-42抗體，置搖床室溫孵育3 h。反復洗板4 次，室溫孵育30 min。每孔加100μl染液覆蓋，37 ℃孵育30 min。取出酶標板，每孔加終止液100μl，輕輕混勻，直至孔中的液體由藍變黃。空白孔調零，30 min內在450 nm波長讀取光密度（OD 值），根據曲線方程求出腦組織中Aβ1-42的濃度。

3 統計學方法 數據分析采用SPSS 13.0統計學軟件進行。實驗數據以均值±標準差（±s）表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05表示具有統計學差異。

結 果

1 Ori改善APP／PS1轉基因小鼠學習記憶能力 各組小鼠定位航行試驗顯示，尋找平臺逃避潛伏期（圖1A）及平均路程（圖1B）隨著測試時間的延長而逐漸縮短。與NT 組相比，Tg組小鼠逃避潛伏期和尋找平臺平均路程延長（P＜0.05），經Ori治療后均顯著縮短（P＜0.05），表明APP／PS1小鼠具有明顯的空間學習障礙，Ori可以改善其能力。空間探索試驗結果（圖2）顯示，Tg組小鼠穿梭原平臺所在象限次數顯著減少（P＜0.05），經Ori治療后次數均明顯增加（P＜0.05），提示APP／PS1轉基因小鼠的空間記憶再現能力降低，Ori可改善其能力。與Tg／Ori-L 組比較，Tg／Ori-H 組逃避潛伏期、尋找平臺平均路程和穿梭原平臺所在象限次數均無統計學差異（P＞0.05），說明Ori改善APP／PS1轉基因小鼠的空間學習記憶能力無劑量相關性。

圖1 各組小鼠尋找平臺逃避潛伏期（A）和尋找平臺平均路程（B）比較

圖2 各組小鼠穿梭原平臺所在象限次數比較

2 Ori調節APP／PS1轉基因小鼠海馬區BDNF和Trk B受體蛋白表達 見圖3。Western blot結果顯示，與NT 組比較，Tg 組小鼠海馬BDNF 和TrkB受體蛋白表達減少（P＜0.05）；與Tg組相比，Tg／Ori-L組和Tg／Ori-H 組小鼠海馬BDNF 和TrkB 受體蛋白表達增加（P＜0.05）；Tg／Ori-H 組小鼠海馬BDNF和TrkB受體蛋白表達與Tg／Ori-L 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 Ori減輕APP／PS1轉基因小鼠海馬區Aβ1-42水平 見表1。ELISA 結果顯示，Tg組小鼠海馬區可溶性Aβ1-42含量及不可溶性Aβ1-42含量較NT 組明顯增高（P＜0.05）；與Tg組比較，Tg／Ori-L 組和Tg／Ori-H 組小鼠海馬區可溶性Aβ1-42含量和不可溶性Aβ1-42含量降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與Tg／Ori-L組比較，Tg／Ori-H 組小鼠海馬區可溶性和不可溶性Aβ1-42含量無統計學差異（P＞0.05）。

圖3 各組小鼠海馬區BDNF和Trk B受體蛋白表達比較

表1 各組小鼠海馬區可溶性及不可溶性Aβ1-42含量比較（±s）

表1 各組小鼠海馬區可溶性及不可溶性Aβ1-42含量比較（±s）

注:與NT 組比較，#P＜0.05；與Tg組比較，*P＜0.05

組 別 可溶性Aβ1-42（pg／mg）不可溶性Aβ1-4（ng／mg）NT 組24.05±4.98 42.06±6.98 Tg組 67.05±8.15# 112.03±11.23#Tg／Ori-L組 32.31±6.32* 76.35±6.42*Tg／Ori-H 組 39.17±9.86* 71.05±7.35*

討 論

Ori是一種水溶性碳苷類黃酮化合物，為葒草、竹葉、金蓮花的主要活性成分。研究表明［1-3］:Ori具有抗氧化應激、抗衰老、抗炎、抗凋亡、神經保護等多種生物學作用，能夠改善Aβ以及噪音誘導的癡呆小鼠的認知功能。但Ori改善癡呆小鼠認知功能的機制目前尚不清楚。

BDNF／Trk B是中樞神經系統的神經保護信號通路之一，其中BDNF 廣泛分布于海馬、皮質和杏仁核等區域［10］，通過與細胞膜上的Trk B 受體特異性結合而激活酪氨酸蛋白激酶，引起酪氨酸殘基的磷酸化，促進神經干細胞的分化和成熟神經元的存活，提升海馬神經元在損傷環境下的自我修復及適應能力，調控神經遞質的合成和釋放，增強突觸可塑性，維持AD 病理環境中樹突的形態和功能，最終改善認知功能［11-12］。研究表明［13-14］:AD 動物模型及患者BDNF和Trk B受體表達均下降，并與年齡和病程呈負相關，給予癡呆動物模型外源性導入BDNF 則有明顯的神經保護作用，減少了Aβ沉積，從而改善了模型的空間學習和記憶能力。本研究中模型組小鼠海馬BDNF／Trk B含量下降，從而導致Aβ1-42 含量增加，與文獻報道一致［15］。Ori可上調小鼠海馬區BDNF／TrkB 的表達，減少Aβ1-42的含量。Aβ沉積形成的老年斑是AD 的經典病理改變，Aβ的生成與清除失衡是AD 的核心發病機制。在體和離體實驗均表明BDNF 能通過下調腦Aβ的表達減少老年斑的形成，保護腦內神經元、顆粒細胞、星型膠質細胞等，從而使神經細胞免受Aβ多聚體的細胞毒性損傷，提高神經細胞的存活能力［15］。本研究中APP／PS1轉基因癡呆小鼠腦內BDNF 和TrkB受體表達減少，Ori能上調BDNF 和TrkB 受體表達，進而減少海馬Aβ沉積，從而提高了空間學習記憶能力。但本研究中Ori影響癡呆動物模型BDNF／Trk B表達無劑量依賴關系，仍需進一步分組研究。