促紅細胞生成素對老年性耳聾小鼠血清和耳蝸組織中IL-6 和IL-17表達的影響*

孫 青，秦雪梅，曹德林，李菊紅，高 萍

1.復旦大學附屬中山醫院青浦分院耳鼻喉科（上海201700）；

2.上海市青浦區朱家角人民醫院耳鼻喉科（上海201700）

老年性耳聾臨床常見，其形成與聽覺系統的衰老、遺傳、高血壓、高血糖、高脂血癥及耳毒性藥物等有關［1］。免疫、炎癥介導因素對促進病變的形成有一定價值。白細胞介素-6（IL-6）和白細胞介素-17（IL-17）均為促進病變形成的重要因子。有研究顯示兩者高表達與老年性耳聾有關［2］。促紅細胞生成素（Erythropoietin，EPO）是一類能夠促進機體造血功能的激素類糖蛋白分子，具有促進造血活性的生物學功能。EPO可能對促炎細胞因子的表達和分泌具有顯著抑制效果［3］。近年研究顯示EPO 對缺血和慶大霉素造成的毛細胞及神經細胞損傷具有保護作用［4］。基于此我們建立老年性耳聾的小鼠模型，應用EPO 進行干預，并進行對照觀察，探討其對血清和耳蝸中IL-6和IL-17的調節作用。

材料和方法

1 實驗動物 實驗動物均由南京大學模式動物研究所提供，選擇5周齡小鼠48只，體重（20.3±5.6）g，無噪聲暴露史和耳毒性藥物應用史，無中耳炎病史。其中36只用于建立老年性耳聾的模型。

2 造模方法 36只小鼠采用腹腔注射的方法，依據每只小鼠的體重注射濃度為150 mg／（kg·d）的D-半乳糖溶液，共60 d，完成老年性耳聾小鼠模型的建立。

3 干預方法 將模型小鼠分為EPO 干預組（EPO 組）、生理鹽水干預組（NS組）和對照組（C 組），均為12只。EPO 組應用EPO 進行干預，以1000 U／kg的濃度，腹腔注射，2次／周，共8周。NS組以等量生理鹽水腹腔注射，2次／周，共8周。C 組不進行任何處理。

4 靜脈血的留取 治療結束后第2天，應用腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠，用剪刀沿腹中線剪開腹部，完全暴露腹腔，將腸道、胃等器官撥開，分離腹部血管，找到下腔靜脈（位于腹部較粗的藍色血管）。將頭皮針下端與5 ml注射器相連，用頭皮針刺入下腔靜脈靠近下端處，抽吸注射器，取2 ml靜脈血，離心后分離血清，置于-80℃冰箱中凍存，備用。

5 耳蝸取材 取血后，用剪刀沿小鼠頸部剪斷皮膚、肌肉和頸椎。從枕骨大孔沿頭正中線依次剪開頭皮層和顱骨，暴露腦組織并去除。沿著正中線將顱底剪開，用眼科剪剪斷兩側顳巖部，找到聽泡，分離出耳蝸。剪去耳蝸周圍骨質，于鹽水中沖洗血漬，置于-80℃冰箱中凍存，備用。

6 檢測方法

6.1 免疫組織化學技術檢測耳蝸組織中IL-6和IL-17的表達:基于術后石蠟包埋組織，切取4μm 切片后嚴格按實驗步驟操作。IL-6和IL-17的一抗為濃縮液，購自上海煊翎生物科技有限公司，二抗和DAB購自北京中杉金橋生物技術有限公司。按不同比例稀釋后行預實驗，選擇IL-6（1∶50）和IL-17（1∶100）的配比濃度（顯色效果最佳）進行實驗，檢測均由同一檢驗師完成，減少人為誤差，做好質控。結果評判:IL-6和IL-17的陽性部位為細胞質，隨機觀察3個顯色明顯的上皮細胞分布區（400倍視野），分別進行陽性率和著色強度的計分。陽性率:≤25%為1 分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。著色強度:無著色為0分，淡黃為1分，棕黃為2分，黃褐為3分。兩者相加為最后得分，分值為0～7分。以≤2分為陰性，＞2分為陽性，計算陽性率。

6.2 ELISA 法檢測血清中IL-6 和IL-17 的表達:嚴格按實驗步驟操作，均由同一檢驗師操作，做好實驗質控工作。

6.3 實時熒光定量PCR 法檢測耳蝸組織中IL-6和IL-17 m RNA 的表達:基于術后新鮮凍存組織，首先提取總RNA。IL-6 引物上游:5'-AAACTGCGTACATGCGCTG-3'，下 游:5'-TACTGTGGCACCGCATCGTT-3'。IL-17 引物上游:5'-CTGCCGTGGGAACCCTAAACGCTG-3'， 下 游:5'-CTGACGTGTGTGGCACTCTT-3'。選擇U6 作為內參，引物上游:5'-GGAACCAGAAAGATTAGC-3'，下游:5'-TTGGAACGCACGAATTCCG-3'。引物由蘇州睿贏生物技術有限公司合成。相關試劑購自美國ABI公司。嚴格按說明書進行操作。反應體系:95℃5 min，循環1次；95℃、25 s，64℃、20 s，72℃、20 s，循環15次；93℃、25s，60℃、35 s，72℃、20 s，循環35次。于60℃收集信號。讀取CT 值，以2-ΔΔCt法計算目的基因的相對水平。

7 統計學方法 應用SPSS 13.0統計學軟件進行分析，行卡方檢驗和方差分析（SNK 法行兩兩比較），以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組耳蝸組織中IL-6和IL-17表達陽性率比較 免疫組化結果顯示:C 組和NS 組IL-6 和IL-17的陽性率明顯高于CK 組，EPO 組IL-6和IL-17的陽性率明顯低于C組和NS組，見表1。

表1 各組耳蝸組織中IL-6和IL-17表達陽性率比較［只（%）］

2 各組血清中IL-6和IL-17表達比較 ELISA結果顯示:C組和NS組血清中IL-6和IL-17的表達量明顯高于CK 組，EPO 組IL-6和IL-17的表達量明顯低于C組和NS組，見表2。

表2 各組血清中IL-6和IL-17表達比較（mg／L）

3 各組耳蝸組織中IL-6 m RNA 和IL-17 m RNA 表達比較 實時熒光定量PCR 結果顯示:C 組和NS組血清中IL-6 m RNA 和IL-17 m RNA 的表達量明顯 高 于CK 組，EPO 組IL-6 m RNA 和IL-17 m RNA 的表達量明顯低于C組和NS組，見表3。

表3 各組耳蝸組織中IL-6 m RNA 和IL-17 m RNA 表達比較

討 論

老年性耳聾是衰老基礎上出現的聽覺系統退行性變，主要與隨著年齡的增加，遺傳因素或內環境穩定性下降，機體、器官、組織細胞功能和結構發生退行性改變有關。近年研究顯示炎癥反應可能是病變形成的重要機制［5-6］。隨著機體內環境穩定的下降，機體中炎癥反應增強，且抑炎介質表達極不穩定，可以引起局部耳蝸毛細胞和支持細胞逐漸減少及神經元發生退變。也有研究顯示耳蝸是代謝旺盛的組織，對缺氧敏感，且底部代謝活動強于頂部，而老年人基礎代謝率低，對耳蝸組織的供血供氧量低，因此可以引起局部的炎癥環境增強，抑炎介質形成減少，使毛細胞的細胞膜上脂質發生過氧化，細胞通透性增強，細胞內外的物質交換紊亂，細胞自溶，聽力下降［7-8］。EPO 早期主要用于促紅細胞生成治療貧血，內源性EPO 的產生主要是腎臟以低氧依賴的方式進行，當EPO 生成不足引起腎性貧血，EPO 通過促使紅系祖細胞增殖和分化來調節紅細胞生成，減弱局部的炎癥反應［9-10］。它的抗炎和組織保護在一些自身免疫病及神經損傷方面得到關注。

本研究結果顯示老年性耳聾小鼠模型血清和耳蝸組織中IL-6和IL-17的表達明顯高于正常小鼠，EPO干預后IL-6和IL-17的表達明顯下降，且與IL-6 m RNA 和IL-17 mRNA 表現出一致性，提示老年性耳聾小鼠耳蝸中IL-6和IL-17高表達，是病變形成的重要促進因子，其高表達是局部炎性損傷的重要標志，是機體急性免疫應答的促發劑［11-12］。EPO 對IL-6 和IL-17的表達有明確的下調作用，顯示EPO 具有對抗促炎因子生成的重要作用。近年發現其具有神經保護、抗細胞凋亡、促血管形成及減弱炎癥反應的作用。也有研究顯示EPO 具有保持線粒體穩定，上調Bcl-2的作用，使局部細胞凋亡受到影響［13-14］。

EPO 能減少炎癥因子的產生，增強抑炎因子的分泌，減少外周血中性粒細胞的數量，抑制中性粒細胞激活等［15］。本研究發現的EPO 下調IL-6和IL-17的作用為解釋EPO 在應用中的抗炎作用提供了重要基礎。

總之，促紅細胞生成素可以減少老年性耳聾小鼠模型血清和耳蝸組織中IL-6和IL-17的表達，減少局部的炎癥反應和免疫反應，對延緩病變的進展及促進病變恢復可能有一定價值。