組織激肽釋放酶7高表達前列腺癌PC-3單克隆細胞株的構建及其侵襲性研究*

呂文鑫，莫曾南，楊小麗

1.廣西壯族自治區柳州市工人醫院（廣西醫科大學第四附屬醫院）泌尿外科（柳州545005）；2.廣西醫科大學第一附屬醫院（南寧530021）；3.廣西醫科大學基因組與個體化醫學研究中心（南寧530021）；4.廣西醫科大學醫學科學實驗中心（南寧530021）

前列腺癌為臨床常見惡性腫瘤，其在西方國家男 性惡性腫瘤發生率中高居首位。其在我國發病率呈現逐年上升趨勢，目前已成為成年男性最常見的惡性腫瘤之一。組織激肽釋放酶7（Kallikrein7，KLK7）為編碼h K7蛋白的人類組織肽釋放酶基因。相關研究中顯示，KLK7可在多種惡性腫瘤中檢出，并呈現異常表達狀態，考慮其可能為某些腫瘤的分子標記物［1-2］。其中，人前列腺特異性抗原（PSA／KLK3）就是該家族成員。為了進一步明確其在腫瘤發生、發展中的機制，本研究擬構建過表達KLK7 基因的前列腺癌穩定細胞株，同時探討對其前列腺癌細胞侵襲和轉移的影響。

材料和方法

1 實驗材料 菌種:TOP10感受態菌（美國Invitrogen公司）；質粒:pcDNA3.1克隆表達載體（美國Invitrogen公司）；細胞:人類前列腺癌細胞系PC-3（中國科學院生物細胞所細胞庫）。主要試劑:反轉錄試劑盒（Ta KaRa公司）、DNA 聚合酶與限制性內切酶Kpn（Ta KaRa 公 司）；LB 培 養 基、TRIzol Reagent試 劑、Lipofectamine 2000試劑（美國Invitrogen公司）；PCR相關試劑（上海生物工程有限公司）；抗體（Abcam）；細胞培養試劑（Gibco公司）；蛋白分子量Marker（賽百勝公司）。

2 研究方法

2.1 PCR 擴增:①以Trizol法提取前列腺組織上皮細胞RNA，-80℃保存；反轉錄合成cDNA 第一鏈，后PCR 擴增。將KOZAK 系列引入引物設計中以提升蛋白表達效率。上游引物:5'ACCATGGCAAGA TCCCTTCTCC3'；下游引物5′TTAGCGATGCTTTTT CATGGTGTC3'。②反應條件:95℃5 min，循環1次；95℃、56℃、72℃各1 min，循環35次；72℃10 min。擴增后產物電泳（1.7%瓊脂糖膠），并系統檢測。

2.2 構建表達載體:①表達載體選pcDNA3.1；將PCR 產物電泳完成后切膠純化，將pcDNA3.1 載體與產物以T4DNA 連接酶連接；轉化至TOP10感受態菌；②以LB 瓊脂平板進行Amp 抗性陽性克隆篩選，挑菌培養后進行質粒提取；③酶切鑒定重組后質粒，并實施DNA 測序，將測得序列與NCBI數據庫內進行比較。

2.3 前列腺癌PC-3細胞轉染:①將前列腺癌細胞PC-3置于100 U／ml鏈霉素F12、100 U／ml青霉素、10%胎牛血清培養液中，存放于5%CO2飽和濕度培養箱中培養。取PC-3對數生長期細胞種于24孔板中，種植標準為2×105細胞／孔密度，過夜后將細胞匯合；②陽離子脂質體載體轉染；③24 h后細胞去舊培養液并重新培養，后進行細胞篩選，篩選標準為500 μg／ml G418；④對照為空載體；⑤單克隆細胞篩選完成后實施細胞擴大培養。

2.4 穩定細胞株鑒定:①鑒定方式選Western blot法，取對照細胞及pcDNA3.1-KLK7轉染的細胞帶，定量后電泳（丙烯酰胺凝膠），后將其電轉至PVDF膜；②在室溫下進行1%BSA 的TBST 封閉，封閉時間為1 h，并加一抗（1∶500）搖床4℃過夜孵育；③TBST洗膜，加二抗（1∶5000）實施1 h 室溫孵育；④洗膜，ECL發光后實施顯影定影。

2.5 細胞侵襲實驗:采用DMEM 將Matrigel稀釋（1∶6），100μl／孔加入Transwell小室，37℃放置1 h，加入600μl含20%FBS的DMEM 培養基，平衡1 h；2×104細胞接種至Transwell上室、鋪勻。在下室內加入含20%FBS的DMEM 培養基600μl，常規培養24 h，取出Transwell小室，甲醛固定30 min，PBS沖洗、晾干，0.1%結晶紫染色。光學顯微鏡放大40倍下隨機觀察5個視野并拍照，對每個視野的陽性細胞進行記數并比對。實驗重復3 次。

3 統計學方法 應用SPSS 18.0統計學軟件處理數據。計數資料以均數±標準差（±s）表示，以單因素方差分析（ANOVA）比較多組間數據。P＜0.05為差異有統計學意義

結 果

1 pcDNA3.1-KLK7載體酶切鑒定 取抽提后質粒實施酶切（KpnI限制性內切酶），載體構圖（圖1）。因KLK7開放讀碼框、pcDNA3.1載體上各存在1個酶切位點，因此酶切插入方向正確后電泳條帶顯示686bp（圖2）。對預期相符質粒DNA 測序驗證。

圖1 pcDNA3.1-KLK7結構及酶切位點位置示意圖

圖2 載體Kpn I限制性內切酶酶切電泳圖

2 PC-3穩定轉染細胞株的KLK7表達鑒定 蛋白免疫印跡結果（圖3）。PC-pcDNA3.1-K7細胞有特異條帶，相同位置對照空載體無目標條帶；特意條帶大小與文獻報道一致，說明經PC-3中h K7蛋白成功表達，而對照組細胞不表達h K7蛋白。選擇表達水平較高的陽性細胞，用于細胞侵襲性的研究。

3 前列腺癌PC-3 單克隆細胞株穩定過表達 KLK7的細胞侵襲性試驗結果表明（圖3），40倍鏡放大下5個隨機視野，轉染的PC-3-KLK7細胞組平均細胞計數為（246.60±23.41）個／HP，對照的PC-3細胞組平均細胞計數為（109.00±8.75）個／HP，兩組比較差異具有統計學意義（P＜0.01）（圖4）。

圖3 轉染細胞及空載體細胞h K7表達比較

圖4 前列腺癌PC-3單克隆細胞株穩定過表達KLK7的細胞侵襲試驗（結晶紫染色，×40倍）

討 論

KLK7（Kallikrein 7）編碼h K7蛋白；該家族分子結構保守，均表達絲氨酸蛋白酶活性［3］。h K7因具有糜蛋白酶活性，且最早被發現位置為皮膚角質層，因此被稱為角質層糜蛋白酶（SCCE），研究中發現h K7在皮屑生理、病理過程中均高度參與，主要原因為h K7能夠降解角質層細胞間連接結構，以此可造成細胞脫落層［4］。

近年來大量研究顯示人體多個器官惡性腫瘤的發生與h K7異常表達具有相關性，例如在對甲狀腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、宮頸癌、結腸癌及前列腺癌等涉及人體多個系統器官的研究中均發現h K7均存在表達異常情況［5-11］，這些腫瘤發生過程中既有激素依賴及非激素依賴，KLK7的表達有上調亦存在下調。同時有研究發現KLK7與E-cad在宮頸癌中的表達呈負相關，兩者在促進宮頸癌侵襲轉移方面可能起協同作用［9］。高原紅細胞增多癥的患者同樣存在激肽釋放酶基因簇（KLK1／3／7／8／12）的過度表達［12］。裸鼠皮下移植瘤模型研究中，KLK7在胰腺導管腺癌組織中呈高表達，是胰腺癌脈管侵犯的獨立危險因素；KLK7可促進胰腺癌增殖，降低化療敏感性，增加胰腺癌細胞侵襲遷移能力［13］。有學者研究表明KLK7可能作為檢測前列腺癌的潛在生物學標志物［14］。在乳腺癌的治療中，激肽釋放酶相關肽酶是潛在的治療靶點［15］。但目前在腫瘤發展過程中h K7的影響機制尚仍不明確，但多數學者均認為其表達變化與腫瘤惡變情況相關［16-18］。

為深入研究其在前列腺癌發生發展中如何參與信號通路、對細胞生長行為的影響等功能，需要進行前列腺癌細胞株中h K7蛋白表達載體的構建。本次研究，選取前列腺癌最常見的PC-3細胞株進行構建，成功構建出KLK7表達載體，并成功獲取不同表達量的PC-3穩定細胞株，將KLK7過表達株篩選完成后并進行下一步研究。同時，對KLK7過表達株的細胞侵襲性試驗表明，KLK7過表達的前列腺癌PC-3細胞，具有更強的細胞表達，提示其可能在前列腺癌PC-3的腫瘤生物學特性中具有重要的作用，本研究可為惡性前列腺癌PC-3細胞發展和轉移及其侵襲和轉移機制提供研究基礎。