SM22α基因啟動子區低甲基化與胃癌發生發展的相關性研究

馬國明 左衛微 梁磊 賈純亮 張磊 劉遠廷 李景武 趙輝

胃癌是一種常見的惡性胃腸道腫瘤，近年來，盡管對胃癌的診斷和治療取得了很大的進步，但胃癌患者5年總生存率仍然較低[1-3]。隨著分子生物學技術的發展，蛋白質組織學技術的廣泛應用可使研究人員發現和鑒定出一些可用于腫瘤診斷、預后評估及靶向治療的生物標志物。平滑肌蛋白22α(smooth muscle 22 alpha，SM22α)是新近發現的一種與胃癌發生有關的分子標志物[4]。SM22α是一種細胞骨架相關蛋白，可通過與細胞骨架的肌動蛋白結合，參與細胞骨架構成并調節細胞的收縮功能。此外，SM22α還可能在細胞分化、遷移、侵襲和細胞外基質重構等過程中發揮重要作用[5,6]。研究表明，SM22α可以通過促進MMP-2的表達從而增加腫瘤細胞的侵襲和轉移能力[7]，在胰腺癌、食管癌、大腸癌等多種腫瘤組織中，SM22α均有不同程度的上調[8-10]。通過應用蛋白質組學技術，Huang等[4，11]發現胃癌組織中SM22α的表達明顯高于正常癌旁組織。然而其表達上調的分子機制目前尚不明確。DNA甲基化在調控真核細胞基因表達方面起重要作用，基因啟動子區CpG島的甲基化可引起染色質構象發生改變，導致轉錄因子無法與其DNA上的結合位點結合，從而抑制基因的轉錄[12]。本研究檢測胃癌組織及正常癌旁組織中SM22α基因啟動子的甲基化狀態及mRNA的表達情況，探討它們的相關性及與胃癌發生發展的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月至2017年10月我院胃癌患者56例的癌組織及相應正常癌旁組織標本(距癌組織>6 cm)；其中男35例，女21例；年齡39～76歲，中位年齡58歲。所有患者術前均未進行放化療治療，所取標本均經過術后病理證實。標本在離體后30 min內采集，迅速放入裝有RNAlater液的凍存管里并浸泡，于4℃冰箱里過夜后轉置于-20℃冰箱里低溫保存備用。標本和資料收集均由患者本人及家屬知情同意，并獲得醫院倫理學委員會批準通過。

1.2 主要試劑與儀器 DNA提取試劑盒(北京天根生物有限公司)；EZ DNA Methylation-Gold試劑盒(美國Zymo Research公司)；PCR反應試劑盒(美國Promega公司)；TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司)；RevertAid cDNA 合成試劑盒(美國Promega公司)；qPCR反應試劑盒(上海凱杰生物技術有限公司)；引物合成(上海生工公司)；熒光定量PCR儀(7500 型)為美國ABI公司產品。

1.3 檢測方法

1.3.1 DNA提取及甲基化特異性聚合酶鏈反應(MSP):應用DNA提取試劑盒提取組織DNA。應用EZ DNA Methylation-Gold試劑盒將DNA進行亞硫酸氫鹽修飾。SM22α甲基化引物：上游引物 5’-AAT AGT GAA GTA GGA GTA GTC GTA AGT TC-3’，下游引物 5’-AAT CTA CCG AAA CTA CCG AAA C-3’；SM22α非甲基化引物：上游引物 5’-GAA TAG TGA AGT AGG AGT AGT TGT AAG TTT-3’，下游引物 5’-CAA TCT ACC AAA ACT ACC AAA AC-3’。將亞硫酸氫鹽修飾的每個組織標本DNA進行2次PCR擴增(一次SM22α甲基化引物擴增；另一次SM22α非甲基化引物擴增)，反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀下攝影成像并保存結果。陽性對照及陰性對照：以甲基轉移酶處理后的正常人外周血DNA為模板，通過上述PCR擴增得到的產物為甲基化陽性對照；無菌去離子水代替模板 DNA 所得的PCR產物為陰性對照。結果判定：由SM22α甲基化引物擴增出目的條帶，SM22α非甲基化引物未擴增出目的條帶者為完全甲基化；由SM22α非甲基化引物擴增出目的條帶，而SM22α甲基化引物無目的條帶者為非甲基化；SM22α甲基化引物和非甲基化引物均擴增出目的條帶者為部分甲基化，也記為SM22α甲基化陽性。

1.3.2 總RNA提取及qRT-PCR:應用TRIzol試劑盒抽提組織總RNA，測定其含量和純度，然后進行逆轉錄。應用RevertAid cDNA合成試劑盒將總RNA逆轉錄合成cDNA。qPCR反應條件設定為：95℃預變性5 min；然后進行35個循環：95℃變性15 s、58℃退火30 s、72℃延伸25 s；最后95℃變性15 s、60℃退火60 s、95℃延伸30 s。反應引物:SM22α上游引物 5’-AGG TGT GGC TGA AGA ATG GCG-3’，下游引物 5’-TCT TCG TCT ACA TAA TCC TC-3’；GAPDH作為內參，上游引物 5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’，下游引物 5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’。 根據樣品的Ct值，采用2-ΔΔCT法進行計算獲得mRNA的相對表達量，每個樣本均設3個副孔，取3次結果平均值為實驗結果。

2 結果

2.1 SM22α在胃癌組織和正常癌旁組織中甲基化狀態和mRNA表達情況 56個胃癌組織標本中，有16個標本檢測到SM22α基因啟動子區的甲基化，甲基化率為28.6%；而正常癌旁組織中檢測到29個，甲基化率為51.8%，2組比較差異有統計學意義(χ2=6.278，P=0.012)。SM22α基因mRNA在胃癌組織中的平均表達量為(1.43±0.53)，在正常癌旁組織中的平均表達量為(0.85±0.34)。胃癌組織中SM22α基因mRNA的表達量顯著高于正常癌旁組織(t=-5.728，P<0.01)。見圖1。

圖1 不同組織標本的甲基化檢測，M甲基化條帶，U非甲基化條帶

2.2 甲基化陽性和陰性的胃癌組織中SM22α基因mRNA表達情況 SM22α基因mRNA在甲基化陽性胃癌組織中的平均表達量為(1.16±0.41)，在甲基化陰性胃癌組織中的平均表達量為(1.54±0.55)。甲基化陽性組織中mRNA的平均表達量明顯低于甲基化陰性組織(t=2.513，P=0.015)。

2.3 SM22α基因甲基化狀態及mRNA表達與胃癌患者臨床病理特征的關系 胃癌組織中SM22α基因啟動子區甲基化狀態與胃癌患者的淋巴結轉移顯著相關(P=0.013)，而與患者的年齡、性別、分化、分期及腫瘤大小無顯著相關性(P>0.05)。胃癌組織中SM22α基因mRNA的表達量同樣與胃癌患者淋巴結轉移顯著相關(P=0.036)，而與其他病理參數無顯著相關性(P>0.05)。見表1。

表1 SM22α基因甲基化狀態及mRNA表達與胃癌患者臨床病理特征的關系

3 討論

本研究比較胃癌患者癌組織和正常癌旁組織SM22α基因啟動子區甲基化狀態及其mRNA表達情況，我們發現胃癌組織中SM22α基因啟動子區的甲基化率顯著低于正常癌旁組織，mRNA表達水平顯著高于正常癌旁組織，且甲基化陽性的胃癌組織中SM22α基因mRNA表達量顯著低于甲基化陰性的胃癌組織。此外，我們還發現胃癌組織中SM22α基因啟動子區甲基化狀態及其mRNA表達水平與胃癌患者的淋巴結轉移有相關性。

SM22α最先在平滑肌細胞中被發現，后來在一些上皮細胞及纖維細胞中發現也有表達[13,14]。SM22α通過和細胞骨架蛋白肌動蛋白結合，在穩定細胞結構及維持細胞分化表型等方面發揮重要作用。近期的一些研究表明SM22α在多種惡性腫瘤組織中表達異常，如在胰腺癌、食管癌、大腸癌等癌組織中均有不同程度表達上調[8-10]。Zhou等[15]研究發現SM22α表達升高可以增加大腸癌細胞的侵襲能力。在胰腺癌細胞株中，SM22α的過表達可提高胰腺癌細胞株增殖能力，增加侵襲和轉移能力[8]。Huang等[4，11]通過應用蛋白質組學技術均發現胃癌組織中SM22α的表達明顯高于正常癌旁組織，本結果與上述研究結果一致，胃癌組織中SM22α基因mRNA的表達水平顯著高于正常癌旁組織，且臨床病理參數分析顯示SM22α的表達水平與胃癌患者淋巴結轉移顯著相關，表明 SM22α基因的高表達可能增加胃癌細胞的侵襲能力，在胃癌發生、發展中起重要作用。然而SM22α在胃癌組織中表達異常的調控機制尚不明確。

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳學修飾，在調控組織特異性基因表達等方面起重要的作用。Yamamura等[16]研究表明平滑肌細胞中SM22α的表達水平主要由其基因啟動子區甲基化狀態來調控。在大腸癌細胞株HT29中，Zhao等[17]應用去甲基化試劑“地西他濱”處理細胞后，SM22α的mRNA及蛋白表達明顯升高。此外，Sayar等[18]報道了乳腺癌組織中SM22α基因呈高甲基化狀態，且其甲基化狀態與SM22α的表達呈負相關性。本研究首次檢測了胃癌組織中SM22α基因啟動子區甲基化狀態，結果發現胃癌組織中SM22α基因啟動子區的甲基化率顯著低于正常癌旁組織，且胃癌組織中SM22α基因甲基化狀態與患者淋巴轉移有相關性。此外，甲基化陽性的胃癌組織中SM22α基因mRNA表達水平顯著低于甲基化陰性的胃癌組織。結果表明胃癌組織中SM22α基因啟動子區的低甲基化可能通過上調其表達水平，從而增加胃癌細胞的侵襲能力，促進胃癌的發生和發展。

綜上所述，胃癌組織中SM22α基因啟動子區的甲基化率顯著低于正常癌旁組織，其mRNA表達水平顯著高于正常癌旁組織，甲基化陽性的胃癌組織中SM22α基因mRNA表達水平顯著低于甲基化陰性的胃癌組織，且SM22α甲基化狀態及mRNA表達均與胃癌患者的淋巴結轉移有相關性。表明SM22α基因啟動子區的低甲基化導致其表達升高可能在胃癌發生、發展中發揮著重要作用，有可能成為胃癌分子診斷和治療的重要靶點。