孕鼠高脂飲食對子代壓力感受器反射和心率變異性的影響

房志琴 張鵬祥 彭偉 張玉平 王亞玲

隨著人們生活水平提高，肥胖率逐年增加，2013年，全球肥胖和超重人群已達 21 億，較20世紀80年代增長約27.5%[1]。兒童肥胖也迅速蔓延，發達國家的兒童肥胖患病人數呈倍數增長，發展中國家近20年的增長率更是超過了發達國家[2]。肥胖和超重妊娠比例也逐年增加[3]。妊娠前肥胖和超重與子代遠期患高血壓等相關心血管疾病密切相關[4]。心血管自主神經功能紊亂參與多種心血管疾病，例如高血壓、心力衰竭及心律失常等[5]。心率變異性(heart rate variability，HRV)是一種無創性檢查心臟自主神經調節功能的一種手段，具有可重復性、可定量、及高敏感性等優點[6]。壓力反射敏感性(baroreflex sensitivity，BRS)反映心血管反射中血壓的變化引起相應的心率反射性變化的敏感性。可作為反映自主神經功能的指標，在高血壓、冠心病以及心律失常等自主神經功能受損疾病中均存在預測價值[7]。目前關于高脂飲食對子代鼠對血壓和心率調控是否異常，其壓力感受器反射敏感性和心率變異性有無差異，筆者發現在國內鮮有報道，因此我們的研究為高脂飲食子代心血管異常的機制研究提供理論依據，為預防超重和肥胖妊娠對子代不良妊娠結局的影響提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠，SPF 級，雌20只，雄10只，體重(250±10)g，購自北京軍事醫學科學院實驗動物中心，動物合格證書 SCXK-軍 2018-0004。隔離環境下飼養，12 h 晝夜交替，溫度(23±2)℃，相對濕度：40%～80%，隨意取食。適應性喂養 1 周，雌雄比例2∶1合籠，次日晨9∶00做陰道拭子，涂片后在光鏡下觀察到精子為受孕成功，當日記為妊娠第1天，孕鼠隨機分成普通飼料喂養組(OCC組)和高脂飲食組(OHH組)，每組10只。子代出生3 d將雌鼠剔除，雄鼠小籠喂養，雄性子代普通飼料組(OCC組)哺乳期仍正常飼料喂養，高質飲食組(OHH組)哺乳期仍高脂飲食喂養，21 d斷乳后2組均給予維持飼料直至3個月大。2組飼料含鈉量一致，因此本實驗所用飼料含鈉量對2組間血壓無差異。飼料均購自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證書：京飼證(2014)06057。普通飼料(型號1032，含蛋白質27.38%，脂肪14.5%，碳水化合物58.12%，能量值3.48 kcal/g)，高脂飼料(型號 H10060，含蛋白質20%，碳水化合物20%，脂肪60%，能量值5.24 kcal/g)。本研究經河北北方學院科技中心動物倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 股動靜脈置管術:每組隨機選取6只3月齡子代雄鼠，3%異氟烷誘導箱中誘導麻醉，1.5% 異氟烷面罩維持麻醉并固定于保溫臺，保持溫在37℃～38℃。股動脈、股靜脈置管，分別用于記錄血壓和給藥，聚乙烯管PE-50 14 cm與PE10管8 cm拼接制成一個插管，PE10 管端向前經股動脈插入腹主動脈(插到膈肌以下水平)，用來描記血壓。股靜脈同樣置管進入下腔靜脈，用于給藥。聚乙烯置管經背部皮下隧道在兩肩胛骨之間穿出，動、靜脈置管暴露體外約2 cm，縫扎、粘合，過程中保證兩管通暢，灌注肝素后塞子封堵。手術后3 d內，每天腿部肌內注射青霉素(4萬U/只) 防止感染。

1.2.2 壓力感受器反射檢測:動靜脈置管術后恢復3 d 進行感受器反射功能檢測，動脈管連接壓力傳感器 ML880，通過 Powerlab 四通道生物機能試驗系統，持續描記清醒動物血壓和心率變化。靜脈插管緩慢泵入α受體選擇性激動劑苯腎上腺素(phenylephrine hydrochloride，PE)1.0 mg/ml升高血壓，血壓升高30 mm Hg后停止給藥，血壓回落至基線水平后(約50～60 min)，緩慢泵入硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)2.0 mg/ml降低血壓，來誘發心血管壓力感受反射。整個過程控制灌流速度(0.003 ml/min)，使血壓 30～45 s時間內，升高或降低 30～40 mm Hg。為排除起始血壓和心率對壓力感受器反射敏感性變化的影響，用給予PE和SNP期間血壓變化值與心率變化值關系的回歸線的斜率，來表示壓力感受器反射敏感性。

1.2.3 無線遙測植入子植入術:所有實驗物品消毒，植入子浸入2%戊二醛消毒12 h，手術前將無線遙測系統的植入子(TA11PA-C40，DSI)放在無菌生理鹽水中浸泡15 min，去除戊二醛。每組再隨機選取6只3月齡子代雄鼠，同樣異氟烷面罩維持麻醉，將植入子導管插入股動脈5 mm，膠水凝固血管穿刺處，發射器主體固定于腹腔內側，加少量青霉素，腹腔臟器復位后縫合腹膜及皮膚，并用酒精消毒縫合處。用磁開關打開發射器內的電源，用小型調幅AM接收器檢測接收到高頻信號。手術后3 d內，每天腿部肌內注射青霉素(4萬U/只) 防止感染。術后5 d進行連續記錄動物在清醒自由活動狀態下的血壓和心率。

1.2.4 心率變異性測定:通過Dataquest軟件描記大鼠血壓和心率，設置采樣頻率為1 000 Hz，每小時采樣1次，每次采樣5 min，監測24 h。應用HRV分析軟件Cardioseries分析HRV，時域指標：相鄰RR間期差值平方和的均方根(RMSSD)，頻域指標LF、HF及LF/HF。根據文獻報道，大鼠的頻譜分析頻段劃分為：極低頻(VLF)為0.04～0.1 Hz，低頻(LF)0.1～1.0 Hz，高頻(HF)為1.0～3.0 Hz，作為分析數據取相應歸一化數據(單位為normalized unit，n．u)。

2 結果

2.1 2組壓力感受器反射敏感性比較 OHH組給予苯腎上腺素升壓誘發心率下降的敏感性與OCC組比較顯著減小(P<0.05)。此外，OHH組大鼠給予硝普鈉降壓誘發心率增快的敏感性與OCC組比也顯著減小(P<0.05)。OHH組壓力反射線的斜率值均小于OCC組(P<0.05)。見圖1、2，表1。

圖1 苯腎上腺素誘導2組平均動脈壓和心率變化的壓力反射線

圖2 硝普鈉誘導2組平均動脈壓和心率變化的壓力反射線

指標OCC組OHH組PE -3.08±0.33-1.36±0.26SNP-4.54±0.89-2.08±0.22

2.2 2組基礎平均動脈壓和心率比較 2組基礎狀態下，平均動脈壓和心率無明顯差異。見表2。

表2 2組基礎平均動脈壓和心率比較

2.3 2組HRV指標比較 時域指標:RMSSD，頻域指標:LF、HF、LF/HF。2組HRV時域RMSSD比較：實驗組RMSSD顯著低于對照組(P<0.05)，2組HRV頻域LF、HF、LF/HF比較，實驗組LF及LF/HF顯著高于對照組(P<0.05)，HF顯著低于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 2組HRV指標比較

3 討論

超重和肥胖妊娠，會對母兒兩代甚至隔代的健康產生深遠影響。因其不僅增加妊娠女性妊娠并發癥及遠期慢病的風險，還能引起子代遠期肥胖、心血管疾病等一系列健康問題，并在代際間引起肥胖及慢病的傳遞[8]。超重和肥胖女性機體內炎性因子、激素、胰島素、三酰甘油、瘦素等代謝調控因子水平較高，影響卵母細胞的成熟和功能，進而降低胚胎質量[9]。此外，還有研究認為，高脂血癥可破壞卵母細胞的代謝調節功能并引起內質網應激，從而使某些蛋白質在生物合成過程中發生錯誤折疊，從而引起子代遠期代謝和心血管疾病的發生[10]。總之，孕期營養過剩可增加子代心血管疾病發病風險這一關系已明確，多項研究表明表觀遺傳學在其中發揮重要作用，高脂飲食子代一些相關基因通過甲基化促心肌細胞纖維化和肥厚[11]。

本研究應用無線遙測技術，在實驗動物清醒狀態下連續、動態監測生理參數的方法，雖然此方法費用較高，但所獲數據更為真實，我國2013版《藥物安全藥理學研究技術指導原則》明確指示測定清醒動物心血管系統指標的采用此法[12]。

高脂飲食誘導的子代肥胖中存在性別差異，并且雄性后代更容易發生肥胖[13]。為此，我們的研究比較了高脂飲食和普通飼料子代雄鼠，在基礎狀態下平均動脈壓和心率，2組無明顯差異。國外一些研究也得出類似結果，Xue等[14]報道了高脂飲食子代表現為交感神經活性增高，可增敏血管緊張素Ⅱ所致的升壓效應，但10周齡基礎血壓無明顯升高。然而，Samuelsson等[15]研究顯示在懷孕前(5～8周)、懷孕期間和哺乳期間長期喂養高脂飼料的母鼠表現出明顯的肥胖，她們的后代從幼年期(30 d)血壓就升高了，交感神經誘導以及黑素-4受體在高瘦素血癥引起的高血壓中發揮關鍵作用。不同的研究機構高脂飲食子代血壓和心率有無變化，什么時間變化，結論有差異性，這可能與高脂飲食周期長短及測血壓的時機有關。

心血管系統自主神經系統由交感和副交感神經共同構成，正常情況下，兩者處于動態平衡，若功能紊亂就引起多種心血管疾病[16]。孕期肥胖預調后代使其易患高血壓，一個可能機制是這些后代調節心血管活動的自主神經平衡偏向了交感神經興奮[17]。鑒于高血壓發病率逐年增高，發病年齡逐步年輕化，人們逐漸將注意力轉向高血壓前期。一項臨床研究表明，高血壓前期的發生可能與自主神經功能失調有關。長時間的交感神經系統持續興奮，會使外周血管平滑肌收縮，血管阻力加大，進而使血壓升高。自主神經功能紊亂、交感神經亢進是產生并維持高血壓的始動因素之一[18]。心臟自主神經系統功能失衡早期常無特異性臨床表現，診斷較為困難。功能紊亂是一個逐步惡化的過程，最初是迷走神經功能受損，進而發展至交感神經功能過度亢進，隨著自主神經調節失衡加重，HRV等參數隨之發生不同程度異常，最終導致心血管事件發生。患者心臟迷走神經活性降低，交感神經活性增強，空腹血糖、收縮壓、年齡、甘油三酯水平等多種心血管危險因素可能是心臟自主神經功能紊亂密切相關[19]。我們的3月齡子代鼠雖然沒有出現基礎血壓升高，但我們猜測已經處于高血壓前期狀態，存在一定的自主神經功能紊亂，迷走神經活性減退，交感神經相對亢進。Zhang等[20]研究，10周齡高脂飲食子代壓力反射敏感性受損、心率變異性降低，子代的自主神經調控出現異常，我們的研究與此結論一致。

HRV分為線性和非線性分析法，其中線性分析法又可分為時域、頻域和時頻分析法等，時域指標RMMSD代表迷走神經對竇性心率的調控作用的大小，其值越低，迷走神經的張力也越低，交感神經的功能也就越亢進[6]。頻域分析法中HF表示副交感神經的活動，而LF既反映了交感神經也反映了副交感神經的作用，但主要由交感神經控制，LF與HF之比通常用來衡量交感與副交感神經系統的均衡性。現已證實刺激迷走神經時，HRV隨之增高；刺激交感神經時，HRV 隨之下降[12]。我們的研究結果表明，高脂組反映迷走神經張力的指標RMSSD和HF均明顯低于對照組(P<0.05)，主要反映交感神經活性的LF高于對照組(P<0.05)，反映交感-迷走神經系統平衡狀態的LF/HF比值高于對照組(P<0.05)。這表明高脂飲食子代雄鼠交感-迷走神經功能不均衡，且交感神經相對興奮。

心血管調控中心下丘腦接受來自動脈壓力感受器、心肺壓力感受器的傳入信息，通過交感和副交感神經將這些信號傳給心臟、血管和腎臟等效應器官[21]。壓力感受器敏感性(BRS)在機體維持穩態的調節中發揮著重要的作用，我們可通過BRS來預見多種疾病的預后和轉歸。若BRS差，則血壓波動不足以被抑制，表現為血壓變異性大，而相應的心率變異性卻減小。血管活性藥物法測BRS，已得到大量數據認可，安全、可靠，是目前最常用的經典方法之一，間接評價迷走神經對心臟的作用，常用藥物包括PE、血管緊張素Ⅱ和SNP等[7]。本研究中實驗組血壓升高的過程中心率的變化并不明顯，BRS敏感性降低，這表明高脂飲食子代發生自主神經功能變化，BRS受損其調節能力明顯低于正常飲食子代，也就是說高脂飲食子代對任何原因引起的血壓波動刺激反應性降低，不能抑制交感神經的興奮性，迷走神經在血壓改變時候的反應能力處于劣勢。在一些病理狀態下例如高血壓或糖尿病，BRS會降低，且女性患者降低幅度高于男性，因此，推測壓力感受器反射功能可能存在性別差異[22]。那么在動物模型中，病理狀態下BRS是否存在性別差異，有待于更深入研究。

圍產期高脂飲食可導致生命早期高血壓，一項國外研究將腸道微生物靶向治療作為高血壓的再編程治療策略值得進一步的臨床研究[23]。同時一些改善自主神經功能的研究國內外也開展，黃俊杰等[24]發現高脂高糖飲食能導致兔心臟自主神經功能紊亂，并促進AS發生，蜂王漿干預后能調整自主神經功能，延緩AS病變。目前，頸動脈壓力感受器激活療法和腎神經去除術已經在臨床實驗中得到評估，這些方法就是通過調節自主神經系統來控制難治性高血壓[21]。Xue等[14]也表明，妊娠期肥胖母鼠的子代對血管緊張素Ⅱ誘導的升壓反應增強，這種升壓效應可通過腎去神經來逆轉。但是，臨床上用來調節自主神經功能，提高BRS的治療方法和藥物目前仍有限，期待未來有更好的手段來治療自主神經失調相關性疾病。