S1pr1沉默對彌漫大B細胞淋巴瘤OCI-LY1細胞增殖和遷移的影響

周穎 羅婷 袁韻 龔玉萍

彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)是成人最常見的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，約占NHL的30%～40%[1]。目前，R-CHOP是DLBCL的標準治療方案，治愈率可達到60%[2]。盡管R-CHOP的成功治療效果有所改善，但復發和難治性疾病的患者仍是該疾病治療的一大挑戰。近年來，高通量技術揭示了DLBCL基因改變的更復雜特征，并發現了新的治療途徑。DLBCL靶向治療的候選通路之一是STAT3通路[3]。STAT3在包括血淋巴樣惡性腫瘤在內的許多癌癥中被活化[4]。STAT3激活， 活化的STAT3(phospho-STAT3,p-STAT3)進入細胞核，導致細胞凋亡、增殖[5]。免疫組化檢測到的STAT3或p-STAT3單獨表達是所有DLBCL患者的不良預后因子[6]。S1pr1是鞘氨醇-1-磷酸(S1P)G蛋白偶聯受體的成員，通過調控ERK、Akt和Rac通路分別引起細胞增殖和遷移等多種生物學效應[7]。最近有據報道顯示，S1pr1也轉錄p-STAT3和增強S1pr1隨后地激活STAT3，建立一個積極的反饋回路，包括S1pr1/p-STAT3途徑，這對于小鼠和人實體瘤以及腫瘤相關骨髓細胞STAT3的持續激活至關重要[8]。霍奇金淋巴瘤(HL)和NHL在細胞系或組織中均有S1pr1的表達，提示S1pr1在這種情況下具有潛在的生物學作用[9]。然而，S1pr1在DLBCL患者中的預后研究鮮有報道。本研究通過沉默OCI-LY1細胞中S1pr1基因的表達，觀察OCI-LY1細胞增殖和遷移情況，并初步探討其可能的機制，為 DLBCL 的治療提供一個新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑及儀器 人DLBCL OCI-LY1細胞 (中國科學院典型培養物保藏中心昆明細胞庫)；S1pr1特異性siRNA和陰性對照(negative control，NC)(上海吉瑪生物科技有限公司)；DMEM 培養基、胰酶、胎牛血清(美國Gibco公司)；細胞計數試劑盒8(CCK-8)(美國Amresco公司)；人淋巴細胞分離液(上海博升生物科技有限公司)；Trizol(美國Invitrogen公司)、PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反轉錄試劑盒(大連TaKaRa公司)、UltraSYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒(寶生物工程大連有限公司)；PCR引物序列設計和合成(大連TaKaRa公司)，引物編號：S1pr1(002215-PN4426784)、β-actin(001973-PN4427975)；細胞蛋白抽提試劑(碧云天生物技術研究所)；鼠抗S1pr1、STAT3、p-STAT3(美國Santa Cruz公司)；鼠抗GADPH單克隆抗體和辣根過氧化物酶HRP標記山羊抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司)；Westen blot試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；CO2培養箱(美國Ther-mo Revco)；HBS-1096B 酶標儀(南京德鐵實驗設備有限公司)；Transwell小室(CORNING科技有限公司，美國)；基質膠、凝膠成像儀(美國UVP 公司)；實時熒光定量PCR儀(BIO-RAD公司)；BIO-RAD垂直電泳儀(美國BD公司)；NanoDrop2000c 型蛋白核酸檢測儀(美國Thermo公司)。

1.2 標本來源 收集我院確診為DLBCL的患者10例，同時選擇10例健康者外周血，利用淋巴細胞分離液提取外周血單個核細胞，加入1 ml Trizol，-80℃保存備用。本研究經我院倫理委員會批準，受試對象均簽署知情同意書，嚴格按照《赫爾辛基宣言》執行。

1.3 細胞培養及轉染 用含胎牛血清的DMEM培養液培養OCI-LY1細胞，隔天換液，當細胞處于對數生長期時進行實驗。實驗分為空白對照組、陰性對照組和S1pr1沉默組。空白對照組在鋪板后72 h收獲細胞，陰性對照組和S1pr1沉默組分別用Lipofectamine法將陰性對照(negative control，NC)和S1pr1特異性siRNA轉染到OCI-LY1細胞，繼續培養72 h后進行相關檢測。

1.4 細胞增殖實驗 按照1.3方法處理細胞，消化后以5×103/孔接種于96孔板中，200 μl/孔，繼續培養72 h，向培養板中加入10 μl CCK-8試劑，繼續培養，用酶標儀在630 nm處測定吸光度值，計算細胞增殖率，每組設3個平行孔。

1.5 細胞遷移能力實驗 按照1.3方法處理細胞，繼續培養72 h，用不含血清培養基的重懸，調整濃度為2×105后接種在24孔Transwell小室中，每孔100 μl，下室加入10%胎牛血清的DMEM培養液，棄上室培養基，用無菌棉簽擦拭去除上室內的細胞，進行固定，用結晶紫染色30 min，沖洗干凈后顯微鏡下觀察細胞，拍照。計數紫色染色的穿膜細胞，即細胞遷移能力，每組設3個平行孔。

1.6 RT-PCR檢測S1pr1 mRNA表達 取保存的外周血標本和按照1.3方法處理細胞，根據Trizol提取試劑盒操作說明書進行總RNA提取，反轉錄合成cDNA，制備20 μl反應體系進行擴增。PCR 擴增反應條件為 95℃ 30 s，93℃ 10 s，60℃ 3 s，40個循環，60℃時采集熒光，以β-actin作為內參，采用 2-ΔΔCt法計算S1pr1表達量。

1.7 Western Blot法檢測S1pr1、STAT3和p-STAT3蛋白表達水平 按照1.3方法處理細胞，消化后5 000 r/min、5 min離心，洗滌2次，加入1 μl PMSF，根據細胞量加入胞蛋白抽提試液，冰浴2 h；4℃、10 000 r/min、15 min，取上清，進行蛋白定量；進行電泳、切膠；孵育一抗、孵育二抗，用凝膠成像系統采集圖像并進行分析，計算目的蛋白與內參蛋白條帶的灰度值比值。

2 結果

2.1 DLBCL患者及健康者外周血單個核細胞中S1pr1 mRNA的表達 DLBCL患者外周血單個核細胞中S1pr1 mRNA相對中位表達水平為13.02(0.54～31.28)，高于健康者的0.74(0.07～5.67)，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 S1pr1沉默對OCI-LY1細胞S1pr1 mRNA和蛋白表達的影響 與空白對照組比較，陰性對照組OCI-LY1細胞中S1pr1 mRNA和蛋白表達變化不顯著，差異無統計學意義(P>0.05)；S1pr1沉默組OCI-LY1細胞中S1pr1 mRNA和蛋白表達較空白對照組和陰性對照組顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2,圖1。

表1 DLBCL患者及健康者外周血單個核細胞中S1pr1 mRNA的表達 n=10

注：與健康者比較，*P<0.05

表2 S1pr1沉默對OCI-LY1細胞S1pr1 mRNA和蛋白表達的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05

圖1 S1pr1沉默對OCI-LY1細胞S1pr1蛋白表達的影響；A.空白對照組；B.陰性對照組；C.S1pr1沉默組

2.3 S1pr1沉默對OCI-LY1細胞增殖和遷移的影響 與空白對照組比較，陰性對照組OCI-LY1細胞增殖率和遷移細胞數變化不顯著，差異無統計學意義(P>0.05)；S1pr1沉默組OCI-LY1細胞增殖率和遷移細胞數較空白對照組和陰性對照組顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3,圖2。

表3 S1pr1沉默對OCI-LY1細胞增殖和遷移的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05

ABC

圖2 S1pr1沉默對OCI-LY1細胞遷移的影響(×200);A.空白對照組；B.陰性對照組；C.S1pr1沉默組

2.4 S1pr1沉默對OCI-LY1細胞STAT3和p-STAT3蛋白表達的影響 與空白對照組比較，陰性對照組OCI-LY1細胞STAT3和p-STAT3蛋白表達變化不顯著，差異無統計學意義(P>0.05)；S1pr1沉默組OCI-LY1細胞STAT3和p-STAT3蛋白表達較空白對照組和陰性對照組顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4,圖3。

表4 S1pr1沉默對OCI-LY1細胞STAT3和p-STAT3蛋白表達的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05

圖3 S1pr1沉默對OCI-LY1細胞STAT3和p-STAT3蛋白表達的影響;A.空白對照組；B.陰性對照組；C.S1pr1沉默組

3 討論

近十年來，基因干預已成為癌癥生物學研究的熱點分子，許多目標基因在腫瘤發生和腫瘤發展中發揮著重要作用。科學家們開始主張通過基因靶向干預，以此作為治療各種惡性腫瘤的新靶點。STAT3在不同的腫瘤中被活化，但其在DLBCL中的作用尚不清楚。盡管STAT3是一個很有前景的癌癥治療靶點，但由于其細胞內定位和缺乏酶活性，有效抑制轉錄因子的活性仍然是一個挑戰[10]。

最近，一種G蛋白偶聯受體S1pr1被發現對某些小鼠腫瘤和人類腫瘤細胞中STAT3的持續激活非常重要。S1pr1可與JAK2發生物理作用，導致STAT3磷酸化增加，p-STAT3可在轉錄水平上調S1pr1的表達，形成前饋循環[11]。STAT3的活化也受白細胞介素6(IL-6)等因素的影響，進一步導致S1pr1過表達[12]。與STAT3相比，S1pr1具有更有利的細胞定位和酶標靶能力。然而，S1pr1在癌癥生物學中的重要性才剛剛開始被認識，其作為人類癌癥治療靶點的潛在重要性還有待進一步評估。在本研究中，我們關注的是S1pr1在DLBCL中的表達和功能。

S1pr1對T淋巴細胞和B淋巴細胞保留在次生淋巴器官中起著至關重要的作用。S1pr1在內皮細胞中也有高表達，這些細胞中S1pr1的表達對腫瘤血管生成和轉移具有重要意義[13]。另一方面，阻斷S1pr1可使淋巴瘤細胞保留在淋巴器官中，這是由于S1pr1存在功能缺陷，這可能會限制淋巴瘤細胞的侵襲潛能[14]。S1pr1信號可以被一種有效的抑制劑FTY720阻斷，FTY720是一種免疫抑制劑，目前正被用于治療多發性硬化癥[15]。除了靶向該通路的藥物FTY720外，S1P配體抗體也被證明可以有效抑制多種小鼠模型的原發性腫瘤生長，近期已進入其他適應癥的臨床試驗[16]。由于已知S1P/S1pr1信號通路與多個重要通路相關，包括T細胞中的mTOR通路和非淋巴細胞中的Akt通路，因此，S1pr1通過STAT3信號通路以外的機制在DLBCLs生物學中的可能作用尚待闡明[17]。另一種可能是使用一種新的體內siRNA干擾技術，利用S1pr1 siRNA不僅可以靶向抑制腫瘤細胞中的S1pr1/STAT3信號，還可以通過激活腫瘤相關的樹突狀細胞、巨噬細胞和B細胞，同時增強抗腫瘤免疫應答[18]。將STAT3與S1pr1共定位于ABC DLBCL組織的腫瘤細胞中，通過S1pr1 siRNA抑制S1pr1成功抑制了STAT3的活性和腫瘤細胞的生長。在目前DLBCL患者的臨床的研究中發現，S1P/S1pr1通路的激活導致DLBCL病情的惡化，因此，除了STAT3，S1P被認為是一個有前途的目的蛋白[19]。有趣的是，最近的一項研究顯示，S1pr1/STAT3信號通路是慢性腸道炎性和結腸炎相關癌癥之間的重要聯系。考慮到S1pr1/STAT3通路在炎性反應和炎性相關癌變中的重要作用，提示S1pr1/STAT3通路可能參與炎性易發區域的淋巴生成[20]。本研究結果顯示，通過沉默S1pr1基因，降低了STAT3和p-STAT3的水平，同時導致OCI-LY1細胞增殖和遷移能力被抑制。

綜上所述，沉默OCI-LY3細胞S1pr1基因可調節STAT3的活性水平，抑制OCI-LY3細胞增殖能力，降低OCI-LY3細胞的遷移能力，為DLBCL的治療提供了一個新的靶標。然而，我們還需要進一步闡明S1pr1功能在DLBCL治療中的具體機制，以驗證我們的發現。