抗癲癇藥丙戊酸影響內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老和血管擬態(tài)的機(jī)制研究

楊宋玲 張慶平 曾秋玲 寧景春

內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)在內(nèi)皮細(xì)胞維持中發(fā)揮重要作用，參與內(nèi)皮化和新生血管的形成[1]。EPCs的這一優(yōu)點(diǎn)對(duì)以缺血組織再生為目標(biāo)的細(xì)胞治療具有吸引力，體外擴(kuò)張EPC可能有助于缺血性疾病的潛在臨床細(xì)胞治療。靜脈注射自體EPCs是可行和安全的，并可能對(duì)特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓成人的運(yùn)動(dòng)能力和肺血流動(dòng)力學(xué)有有益的影響[2,3]。雖然這些研究為臨床應(yīng)用EPCs提供了各種見解，但潛在的細(xì)胞治療方法的一個(gè)主要限制是循環(huán)血液中EPCs的數(shù)量有限(<白細(xì)胞的0.05%)[4]。因此，體外擴(kuò)增EPCs是必要的。然而，EPCs的體外培養(yǎng)導(dǎo)致EPC衰老的迅速開始，從而嚴(yán)重限制了EPCs的增殖能力和克隆擴(kuò)增潛力[5]。因此，關(guān)于潛在的細(xì)胞治療方法，一個(gè)重要的問題是體外擴(kuò)張引起的EPCs衰老是否可以通過藥物、細(xì)胞因子治療來延遲[6,7]。大多數(shù)抗癲癇藥物在臨床應(yīng)用中的作用機(jī)制尚不完全清楚。抗癲癇藥物可改變多種生理機(jī)制[8]。丙戊酸延遲EPCs衰老的發(fā)生，這可能與PI3K/Akt通路有關(guān)，我們研究了EPCs衰老和增殖的調(diào)控[9]。丙戊酸的劑量和時(shí)間可以顯著增加EPCs的數(shù)量和活性，所以我們進(jìn)一步闡明丙戊酸對(duì)EPC衰老的潛在作用。VM是高侵襲性腫瘤細(xì)胞模擬血管內(nèi)皮細(xì)胞ECs形成高度排列的管狀通道，這些通道發(fā)揮血管的功能，內(nèi)壁完全由腫瘤細(xì)胞構(gòu)成，不含ECs[9]。VM是一個(gè)多步驟的過程，包括腫瘤細(xì)胞的活化、增殖、腫瘤細(xì)胞向內(nèi)皮樣細(xì)胞分化和生成新的功能血管[10]。然而VM背后的許多機(jī)制仍然不清楚。因此我們研究抗癲癇藥丙戊酸影響EPCs衰老和血管擬態(tài)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 循環(huán)EPC的分離與培養(yǎng):用Ficoll密度梯度離心法從健康志愿者的外周血中分離出單核細(xì)胞(MNCs)，并在199σ培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，培養(yǎng)皿中加入10%胎牛血清和VEGF(50 ng/ml,Chemicon)。在激光掃描聚焦顯微鏡下，EPCs表現(xiàn)為黏附細(xì)胞雙陽性，可吸收dildl并結(jié)合凝集素。通過流式細(xì)胞術(shù)顯示KDR、CD34和AC133的表達(dá)，進(jìn)一步證明了它們的存在。醫(yī)學(xué)倫理學(xué)問題:所有實(shí)驗(yàn)程序經(jīng)醫(yī)學(xué)和健康研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，參與者在入組前均提供書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 菌落分析:培養(yǎng)4 d后，用EDTA輕輕分離粘附細(xì)胞。用100 ng/ml人重組VEGF將細(xì)胞(1×105)接種于甲基纖維素板中。平板在顯微鏡下進(jìn)行研究，培養(yǎng)10 d后由兩名獨(dú)立研究者對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.2 EPCs增殖試驗(yàn):通過加入5-溴-2-脫氧尿苷(brdu)來評(píng)估EPC的增殖。細(xì)胞(1×104細(xì)胞/孔)在96孔塑料板中培養(yǎng)。將Brdu(10 μm)添加到培養(yǎng)基和細(xì)胞再培養(yǎng)18 h。根據(jù)說明書，用細(xì)胞增殖酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)測(cè)定BrdU摻入量。

1.2.3 增殖活性測(cè)定:用比色法3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲基氧基苯酚-2-(4-磺苯基)-2H-四唑(MTS)分析測(cè)定有絲分裂活性。在每4小時(shí)加入丙戊酸進(jìn)入EPCs后，培養(yǎng)14 d后收獲EPCs，再在96個(gè)孔板(110個(gè)4個(gè)細(xì)胞)中接種0.1 ml EBM-2培養(yǎng)基，在重組人VEGF的存在下添加0.5%牛血清白蛋白(100 ng/ml；明尼阿波利斯，明尼蘇達(dá)，美國(guó))。培養(yǎng)24 h后，將MTS甲硫酸氫鈉溶液添加到每個(gè)孔中3 h，并使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定板(美國(guó)馬里蘭州肯辛頓生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室)檢測(cè)490 nm處的光吸收率。

1.2.4 衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性測(cè)定:用β-半乳糖苷酶染色試劑盒(biovision)測(cè)定衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(sa-b-gal)活性。在PBS中清洗EPC，在室溫下用0.5 ml固定液固定10～15 min，在37℃下用染色液混合物清洗和培養(yǎng)過夜。在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)藍(lán)色(200倍總放大倍數(shù))。

1.2.5 西方墨點(diǎn)法:采用丙戊酸治療EPC 24 h。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠上制備和分離細(xì)胞蛋白，分離后，蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜(Amersham)。在含有0.1%(v/v)吐溫20和5%(v/v)非脂肪干乳的Tris緩沖鹽水(pH值7.5)中培養(yǎng)2 h，然后在室溫下用多克隆抗磷酸Akt-Ser 473或抗Akt抗體(細(xì)胞信號(hào)技術(shù))培養(yǎng)2 h，阻斷細(xì)胞膜。過濾器在含有0.1%(v/v)吐溫20的三緩沖鹽水中廣泛清洗，然后與過氧化物酶結(jié)合的二級(jí)抗阿巴特抗體培養(yǎng)1 h。然后使用EZ-ECL檢測(cè)試劑盒(生物工業(yè))沖洗。

1.2.6 熒光染料注射:通過靜脈注射熒光染料證明VM，熒光團(tuán)結(jié)合的凝集素與GFAP+膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞共定位，多普勒成像觀察注射微泡，PI3K通路激活膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1。

1.2.7 培養(yǎng)基中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子蛋白的測(cè)定:為了評(píng)估血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子蛋白的分泌，在第14天使用丙戊酸治療的EPC(1×106)被切換到無生長(zhǎng)因子培養(yǎng)基EBM-2，用5%胎牛血清培養(yǎng)72 h。根據(jù)說明書，使用市售的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子夾心免疫分析(R&D系統(tǒng))測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)基中的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子蛋白。檢測(cè)系統(tǒng)與血小板源性生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子無交叉反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 丙戊酸阻止EPCs衰老 EPCs的培養(yǎng)導(dǎo)致SA-B-gal陽性細(xì)胞增加，與丙戊酸共培養(yǎng)可顯著改變SA-B-gal陽性細(xì)胞，EPCs衰老的抑制作用與丙戊酸呈劑量依賴性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2 丙戊酸對(duì)EPCs增殖的影響 BrdU摻入試驗(yàn)表明，丙戊酸處理的EPCs的有絲分裂潛能超過未處理(對(duì)照組)EPCs，這一效應(yīng)與劑量有關(guān)(P<0.05)。見表2。

2.3 丙戊酸對(duì)EPCs克隆擴(kuò)增的影響 在丙戊酸存在或不存在的情況下，將1×105EPCs接種于甲基纖維素平板中。經(jīng)過丙戊酸預(yù)處理的EPCs菌落數(shù)量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。見表3。

表1 丙戊酸影響EPCS衰老結(jié)果

表2 丙戊酸對(duì)EPCs增殖的影響

表3 丙戊酸對(duì)EPCs克隆擴(kuò)增的影響

2.4 丙戊酸對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子分泌的影響 在72 h內(nèi)，丙戊酸處理的EPC培養(yǎng)基VEGF濃度明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。見表4。

表4 丙戊酸對(duì)VEGF濃度的影響

2.5 丙戊酸通過PI3K/Akt通路誘導(dǎo)端粒酶活性 PI3K/Akt通路參與了丙戊酸誘導(dǎo)酶的激活。EPCs在與丙戊酸培養(yǎng)前，先用磷脂酰諾西醇3激酶(PI3K)阻滯劑wortmannin或LY294002預(yù)處理，然后評(píng)估酶的活性。無論是wortmannin還是LY294002都能明顯減弱丙戊酸對(duì)酶活性的增加。接下來我們研究丙戊酸是否會(huì)誘導(dǎo)Akt磷酸化，用不同丙戊酸刺激EPCs 24 h，用anti-phospho-Akt或anti-Akt antibody免疫印跡。丙戊酸刺激引起劑量依賴Akt的磷酸化，但并不影響Akt的總量。見表5。

表5 丙戊酸對(duì)EPCs酶活性的影響

2.6 丙戊酸激活PI3K通路 通過脈注射熒光染料發(fā)現(xiàn)丙戊酸通過PI3K通路激活膜型基質(zhì)金屬蛋白-1，膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1能夠激活MMP-2的蛋白水解作用，從而影響VM。見圖1。

圖1 熒光染料染色圖 PI3K通路也對(duì)應(yīng)于VM的基底板連續(xù)切片雙染色，驗(yàn)證丙戊酸通過PI3K通路激活膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1

3 討論

腫瘤細(xì)胞形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)可能需要凋亡細(xì)胞死亡來清除不包括在血管網(wǎng)中的多余細(xì)胞，而血管網(wǎng)沒有開啟導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞向內(nèi)皮樣細(xì)胞分化的基因程序[11]。細(xì)胞衰老被廣泛認(rèn)為是一種末梢生長(zhǎng)停滯的一般生理過程，可由有限數(shù)量的細(xì)胞分裂觸發(fā)[12]。衰老細(xì)胞雖然不增殖，但其代謝和綜合活性保持不變，其形態(tài)發(fā)生特征性變化，細(xì)胞形態(tài)變大、變平，胞質(zhì)形態(tài)呈空泡狀，顆粒度呈增大的[13]。衰老被認(rèn)為是正常細(xì)胞中必不可少的抗癌程序，與凋亡類似，衰老也能干擾腫瘤生長(zhǎng)。SA-B gal可以反映衰老細(xì)胞溶酶體重的增加，其表達(dá)被廣泛用作細(xì)胞衰老的可靠指標(biāo)[14]。一些腫瘤細(xì)胞為了促進(jìn)VM結(jié)構(gòu)的形成而激活凋亡和衰老。此外，衰老細(xì)胞還產(chǎn)生許多影響其他腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的因子，這些因子可能影響VM的形成。可見衰老參與VM的形成。丙戊酸能夠阻止EPCs的衰老，而EPCs的衰老與高增殖能力和顯著增加的克隆擴(kuò)增有關(guān)[15]。EPCs是由外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生的，為了評(píng)估衰老，檢測(cè)酸性b-半乳糖苷酶作為細(xì)胞衰老的生化標(biāo)記物。EPCs的培養(yǎng)導(dǎo)致SA-B-gal陽性細(xì)胞的增加。與丙戊酸共培養(yǎng)可顯著抑制SA-B-gal陽性細(xì)胞的增加。EPCs衰老的抑制作用呈劑量依賴性。BrdU摻入試驗(yàn)表明，丙戊酸能促進(jìn)細(xì)胞增殖。

證明丙戊酸延緩衰老的發(fā)生后，我們研究了這種作用是否轉(zhuǎn)化為增殖活性和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子分泌的增加。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的分泌作為一種機(jī)制，可能有助于它們的促血管生成作用。MTS分析表明，丙戊酸處理的EPC的有絲分裂潛能超過了未處理EPC的有絲分裂潛能，丙戊酸處理的EPC的培養(yǎng)基中的VEGF濃度明顯高于未處理的EPC。

Akt在調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老方面發(fā)揮重要作用。此外，PI3K/Akt通路在阿托伐他汀介導(dǎo)的EPCs衰老預(yù)防中發(fā)揮重要作用[16]。我們檢驗(yàn)了PI3K/Akt通路參與了丙戊酸誘導(dǎo)的激活。EPCs在與丙戊酸培養(yǎng)前，先用磷脂酰諾西醇3激酶(PI3K)阻滯劑wortmannin或LY294002預(yù)處理，然后評(píng)估其酶活性。無論是wortmannin還是LY294002都能明顯減弱丙戊酸對(duì)酶活性的增加。丙戊酸誘導(dǎo)Akt磷酸化，Akt是PI3K的下游效應(yīng)因子。用不同丙戊酸刺激EPCs 24 h，用免疫印跡法，丙戊酸刺激引起劑量依賴Akt的磷酸化，但并不影響Akt的總量。我們發(fā)現(xiàn)丙戊酸顯著增加了Akt磷酸化。絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt，也被稱為蛋白激酶B，通過在人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞中磷酸化叔丁基化來增強(qiáng)酶活性。除了叔丁酸的直接磷酸化，Akt也可能通過增加內(nèi)皮一氧化氮合酶(enos)的活性，因?yàn)橐呀?jīng)證明一氧化氮能延緩內(nèi)皮細(xì)胞衰老。然而，非供體亞硝基異戊胺(SNAP)并不能阻止EPC的衰老和抑制NO合成酶的表達(dá)。G-單甲基-L-精氨酸(LNMA)沒有加速EPC衰老的發(fā)生，這表明EPC衰老的調(diào)節(jié)獨(dú)立于NO。數(shù)據(jù)表明丙戊酸增加了EPC中的Akt磷酸化，這可能導(dǎo)致叔丁酸的磷酸化增加。叔丁酸磷酸化的增加可能增強(qiáng)酶活性，從而阻止EPC的衰老。

丙戊酸通過PI3K通路激活膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1，在VM的發(fā)生中起重要作用。膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1能夠激活MMP-2的蛋白水解作用，后者將LN-5γ2鏈水解后形成的片段有助于VM發(fā)生過程中腫瘤細(xì)胞的遷移。

綜上所述，本研究結(jié)果表明丙戊酸通過激活酶和Akt磷酸化延緩EPCs衰老的發(fā)生。丙戊酸對(duì)EPCs衰老的抑制作用和體外誘導(dǎo)EPCs增殖可能提高EPCs的功能活性，對(duì)潛在的細(xì)胞治療具有重要意義。丙戊酸通過PI3K通路斷拮抗VM的發(fā)生。