澳洲茄胺抑制人骨肉瘤細胞生長的實驗研究

曾斌 黃云川 曹曉磊 茍林

骨肉瘤(osteosarcoma)是原發惡性骨腫瘤，主要發生于兒童期，需通過手術治療，并輔以化療改善患者的生存情況，但其5年生存率僅為5%～20%[1]。骨肉瘤惡性程度高，極易發生擴散和轉移，是預后差的重要因素，因此研究骨肉瘤的發生機制及侵襲轉移機制成為研究的熱點[2]。肝癌、肺癌、腸癌等研究中發現澳洲茄胺具有抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡的作用[3-5]。同時在易擴散和轉移的肺癌和腸癌中發現，澳洲茄胺具有抑制腫瘤侵襲轉移的作用[6,7]，但目前澳洲茄胺對骨肉瘤的作用尚不可知。AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路在諸多研究報導是腫瘤細胞增殖、調亡、侵襲和遷移的交匯點，是參與腫瘤發生發展等過程的重要信號通路之一[8-10]。因此本文研究了澳洲茄胺對骨肉瘤細胞增殖、調亡和侵襲轉移生物學功能影響，并對其機制進行探討，為進一步揭示澳洲茄胺抗腫瘤作用靶點及臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞培養與處理 人骨肉瘤細胞MG-63的培養：購買于ATCC，是一株貼壁細胞，使用10%胎牛血清 (Gibco)的DMEM培養液 (Gibco)培養于37℃、5% CO2培養箱中。澳洲茄胺處理：將細胞接種于孔板中，于37℃、5% CO2培養箱中培養24 h，加入一定濃度的澳洲茄胺，于培養箱中培養48 h。

1.2 MTT實驗 MG-63細胞接種于96孔板培養24 h后，用含不同濃度澳洲茄胺的培養基替換原培養基，每個濃度設復孔3個，并設空白對照組，孵育48 h后向每孔加MTT液孵育1 h，然后加入20% SDS后測各孔光密度值。實驗重復3次以上取平均值。

1.3 細胞凋亡 MG-63細胞接種于6孔板培養24 h后，用含不同濃度澳洲茄胺的培養基替換原培養基培養48 h，再用胰酶消化并收集細胞，PBS洗2次并收集細胞，后續步驟根據Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒(生工)說明書操作。

1.4 Transwell實驗 遷移實驗：胰酶消化骨肉瘤細胞，分裝成兩管，分別用無血清DMEM培養基 (對照組)和含50 μmol/L澳洲茄胺的無血清DMEM培養基(實驗組)重懸，并使細胞終濃度為1×106個/ml。取100 ml細胞懸液加入transwell上室，在細胞下室24孔板中加入500 ml含10% FBS的DMEM培養基，每組設3個復孔。48 h后取出小室，吸棄上室培養基，用棉簽輕拭去上室細胞，結晶紫染色5 min，PBS洗滌3次。在光學顯微鏡下，在五個隨機區域對侵入的細胞進行計數。侵襲實驗：預先用無血清DMEM稀釋Matrigel至終濃度為100 μg/ml，鋪于Transwell小室底部，4℃風干。每孔加入50 ml含10 g/L BSA的無血清DMEM，于37℃培養箱放置30 min水化基底膜，其余步驟同遷移實驗。

1.5 Western blot 用IP裂解液(Thermo Fisher Scientific)裂解并收集細胞，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒 (碧云天)檢測總蛋白濃度。加入適量的SDS-PAGE上樣緩沖液 (碧云天)，100℃沸水浴10 min，置于冰上冷卻。取20 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，并轉移到硝酸纖維膜上，在室溫下用5%的脫脂奶粉封閉2 h，然后用HMGB1、TLR4、NFκB的一抗4℃孵育過夜。PBST洗滌3次后，用對應的辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h。洗滌3次后，用ECL顯色液 (碧云天)顯色，于凝膠成像儀器下曝光和拍照。使用Image J軟件測定灰度值。

2 結果

2.1 澳洲茄胺對MG-63增殖的影響 MTT結果顯示，在相同的處理時間內，澳洲茄胺處理后細胞的抑制率顯著增加，且隨濃度增加抑制率越高；在相同濃度澳洲茄胺處理條件下，細胞抑制率則隨時間延長而不斷上升(P<0.05)。通過澳洲茄胺處理48 h時澳洲茄胺濃度與細胞抑制率趨勢線，計算出澳洲茄胺對MG-63的半抑制濃度為54.03 μmol/L。見表1，圖1。

表1 澳洲茄胺對MG-63抑制率的影響

注：與0 μmol/L比較，*P<0.5；與10 μmol/L比較，#P<0.05；與20 μmol/L比較，△P<0.05；與40 μmol/L比較，☆P<0.05；與60 μmol/L比較，▲P<0.5

2.2 澳洲茄胺處理細胞，檢測細胞凋亡情況 應用Annexin-V/PI雙染法檢測澳洲茄胺處理前后MG-63細胞調亡率發現：用50 μmol/L澳洲茄胺處理組的細胞早期凋亡率(7.83±1.28%)和晚期凋亡率(15.03±1.24%)均明顯高于對照組的早期凋亡率(3.23±0.84%)和晚期凋亡率(3.62±0.61%)，差異均有統計學意義(P<0.01)。用50 μmol/L澳洲茄胺處理組的細胞總凋亡率(22.74±0.58%)明顯高于與不用澳洲茄胺處理的對照組的細胞總凋亡率(6.71±0.12%)，差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

2.3 澳洲茄胺處理細胞，檢測細胞侵襲轉移情況 Transwell實驗結果顯示，50 μmol/L澳洲茄胺處理過的細胞遷移能力(294±8)個/視野與侵襲能力(181±16)個/視野均明顯低于對照組細胞遷移能力(406±13)個/視野和侵襲能力(295±10)個/視野，差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖3。

圖1 澳洲茄胺處理48 h時，澳洲茄胺濃度與細胞抑制率的關系

圖2 Annexin-V/PI雙染法檢測澳洲茄胺處理前后MG-63的細胞調亡率

2.4 澳洲茄胺對骨肉瘤細胞AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路的作用 Western blot結果顯示，與對照組相比，AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路中AKT、GSK-3β、β-catenin蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)，澳洲茄胺處理組的pAKT(灰度值：72.724，t=37.90,P<0.01)、pβ-cateninze(灰度值：119.606，t=41.82,P<0.01)均顯著低于對照組PAKT(灰度值：131.510)、pβ-cateninze(灰度值：135.544)，并且澳洲茄胺處理組pGSK-3β(灰度值：49.612)顯著高于對照組(灰度值：49.344)。見圖4。

圖3 澳洲茄胺對細胞遷移和侵襲能力的影響；A Transwell檢測2組細胞的遷移情況；B Transwell檢測2組細胞的侵襲情況

圖4 澳洲茄胺處理前后AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路活化情況； A Western blot檢測2組細胞中AKT、GSK-3β、β-catenin、pAKT、pGSK-3β和pβ-catenin的蛋白情況；B 灰度分析Western blot檢測結果

3 討論

骨肉瘤以紡錘形的惡性腫瘤細胞形成不成熟的骨為病理特點，是原發惡性骨腫瘤，在兒童期最為多見[1]。目前治療方法以手術為主，輔以化療改善患者的生存情況[3]。但由于骨肉瘤本身惡性程度高、對化療不敏感、極易發生轉移等特點，截肢后5年生存率并不理想[2]。目前針對骨肉瘤發生機制、耐藥問題以及轉移侵襲相關機制的研究越來越多的受到關注。因此通過本研究對骨肉瘤生長、侵襲轉移的研究，有助于控制腫瘤的發生與轉移，提高患者生存率，對骨肉瘤治療和預后評估等具有重要的臨床意義。

研究發現以龍葵為主要藥物組成的灌腸方治療腸癌療效顯著[11]。進一步研究顯示灌腸方的水提物和醇提物中均檢測到龍葵的活性成分澳洲茄胺、澳洲茄堿及澳洲茄邊堿，其中前者是后二者水解后的苷元，這三種成分在腸癌治療中均顯示了較強的藥理活性[12,13]。澳洲茄胺是來源于茄屬植物的一種甾體生物堿，具有多種藥理活性，其抗腫瘤活性是目前研究的熱點之一[14]。已有研究發現澳洲茄胺對腸癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌、膠質瘤細胞增殖均有抑制作用，對乳腺癌、口腔表皮樣癌、慢性粒細胞白血病、前列腺癌細胞凋亡均有促進作用，但作用機制尚未明確[14-18]。本文以骨肉瘤MG-63細胞為研究對象，探討澳洲茄胺對骨肉瘤細胞的生物學行為的影響，結果發現澳洲茄胺具有抑制骨肉瘤細胞MG-63的增殖和侵襲轉移的作用，并且能夠誘導細胞凋亡，這將為今后臨床治療骨肉瘤提供新的理論參考。

AKT/GSK-3β/β-catenin是PI3K與Wnt兩條信號通路的關鍵分子交匯成的一條通路，調控著腫瘤細胞的生物學行為[8]。在結直腸癌研究中發現，AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路的活化能夠誘導腸癌細胞上皮間質化的發生，進而促進腸癌細胞的侵襲轉移[19,20]。另有在結直腸癌研究中腸癌細胞的增殖抑制、細胞調亡、周期阻滯與AKT磷酸化減弱，GSK-3β活性增加，胞漿內β-catenin的降解密切相關[19,20]。本文研究發現澳洲茄胺對骨肉瘤細胞MG-63的增殖、凋亡和侵襲轉移作用，可能與AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路的活化相關。本研究初步探討了澳洲茄胺對人骨肉瘤細胞的生物學作用及機制，但是仍然有許多不足之處：(1)本研究發現澳洲茄胺對MG-63細胞的生長發揮著重要作用，但澳洲茄胺是否普遍作適用于其他骨肉瘤細胞，尚不可知；(2)本研究發現澳洲茄胺通過AKT/GSK-3β/β-catenin影響細胞增殖、凋亡和侵襲轉移，但缺乏信號通路下游分別調控細胞增殖、凋亡和侵襲轉移的蛋白的研究；(3)澳洲茄胺調控AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路的機制，還需要進一步探討；(4)本文僅在細胞水平探討澳洲茄胺對骨肉瘤的作用，實驗結果的穩定性和可靠性均不如動物實驗，因此仍然需要進一步構建體內動物模型以驗證結論。

綜上所述，澳洲茄胺通過活化AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路誘導細胞凋亡、抑制骨肉瘤細胞增殖和侵襲轉移，進而可能控制骨肉瘤的發生與轉移，提高骨肉瘤患者生存率。