白內障晶狀體上皮細胞中miR-126和caspase-3的表達關系及意義

程麗娜 閆春妮 宋蔚

白內障是由遺傳、免疫及外部傷害等其他先天性或后天性因素導致的一種眼部疾病。臨床主要表現為單側或雙側、晶狀體渾濁、視物不清晰等，常發生于40歲以上人群，發病率隨年齡增大而升高。據報道全球因白內障致盲的人數占40%以上[1]，其中約一半病例發生在亞洲等發展中國家，視力損害給患者生活造成極大不便，但白內障發病機制至今尚未完全明確。因此，不斷尋找有效的診斷指標，探求白內障的發病機理對病情防治十分重要。研究表明白內障發病的首要環節是晶狀體上皮細胞凋亡，現今已發現miR-125、miR-181及miR-126等多種miRNA能夠通過調控人晶狀體上皮細胞凋亡，影響白內障進程[2]，caspase-3是與細胞凋亡有關的調節因子，其表達量一定程度上可以反映出凋亡發生情況[3]。筆者查閱發現對于miR-126與caspase-3在白內障疾病中作用及二者與晶狀體上皮細胞凋亡的關系鮮有報道。本研究擬通過檢測白內障晶狀體上皮細胞中miR-126、caspase-3表達情況，分析二者與白內障患者晶狀體上皮細胞凋亡的聯系，旨在探討二者在白內障疾病發生中作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年5月至2018年6月本院收治的78例白內障患者為觀察組，其中男37例43眼，女41例46眼；年齡45～76歲，平均年齡(61.24±5.36)歲；同期選取52例正常人(角膜移植術供體)為對照組，男24例24眼，女28例28眼；年齡45～75歲，平均年齡(60.12±4.95)歲。2組研究對象一般資料差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入與排除標準 白內障患者納入標準：(1)經確診符合白內障診斷標準[4]；(2)患者均對本研究知情，并簽署知情同意書；(3)角膜散光<1.00D。排除標準：(1)合并青光眼、視神經炎及其他眼底疾病；(2)合并高血壓、糖尿病及其他繼發性視力減退疾病；(3)自身免疫疾病、精神疾病及感染性疾病。

1.3 主要試劑及儀器 RNA提取試劑盒：購自于賽默飛世爾科技公司；SYBR?Green Kit：購自上海翊圣生物科技有限公司；引物：由南京科佰生物科技有限公司合成；多功能酶標儀、qRT-PCR儀：購自美國Bio-Rad公司；流式細胞儀：購自艾森生物科技有限公司。

1.4 研究方法

1.4.1 樣品采集與保存:采用超聲乳化白內障吸除術，收集患者晶狀體上皮細胞樣本，培養于DMEM細胞培養液中，置于37℃、CO2體積分數為5%的恒溫培養箱中培養48 h。

1.4.2 晶狀體上皮細胞中miR-126、caspase-3水平:收集晶狀體上皮細胞，采用RNA提取試劑盒提取晶狀體上皮細胞中總RNA，反轉錄得cDNA。采用定量PCR儀分別對miR-126、caspase-3進行擴增。qRT-PCR分別采用SYBR?Green Kit試劑盒，反應體系均為10 μl，具體步驟參見說明書；miR-126反應條件：95℃：40 s；95℃：10 s；55℃：30 s，共40Cyc；caspase-3反應條件：94℃：30 s；55℃：45 s；72℃：45 s，共30Cyc。miR-126及內參U6、caspase-3及內參β-actin的引物序列見下表。采用2-ΔΔCT法對miR-126、caspase-3表達水平進行定量分析。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4.3 晶狀體上皮細胞中caspase-3蛋白表達水平:Western blotting法測定晶狀體上皮細胞中caspase-3蛋白表達水平，加入裂解液靜置40 min后，12 000 r/min離心30 min，取上清，進行SDS-PAGE電泳，再轉移至PVDF薄膜上，加入一抗(anti-caspase-3)4℃孵育過夜，加入HRP標記的IgG二抗稀釋液室溫孵育2 h后，以β-actin為內參，進行拍照并計算caspase-3/β-actin值。每個樣品測定3次，取平均數。

1.4.4 晶狀體上皮細胞凋亡率的測定:使用胰蛋白酶處理各樣本培養細胞，磷酸緩沖液洗滌后，離心10 min(2 000 r/min)，棄上清，將細胞濃度調至100 000/ml，滴加雙染劑靜置20 min后，轉至冰上，分別加500 μl結合緩沖液，混合均勻，放入流式細胞儀中進行檢測。

2 結果

2.1 晶狀體上皮細胞中miR-126、caspase-3 mRNA水平比較 觀察組患者晶狀體上皮細胞中miR-126水平顯著高于對照組，caspase-3 mRNA水平顯著高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 正常對照組及觀察組晶狀體上皮細胞中miR-126、Caspase-3 mRNA水平比較

2.2 晶狀體上皮細胞中caspase-3蛋白水平比較 觀察組白內障患者晶狀體上皮細胞caspase-3蛋白水平顯著高于對照組(P<0.05)。見圖1，表3。

圖1 Western印跡觀察晶狀體上皮細胞中caspase-3蛋白表達情況

2.3 晶狀體上皮細胞凋亡率比較 觀察組白內障患者晶狀體上皮細胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.05)。見表4。

表3 正常對照組及觀察組晶狀體上皮細胞中caspase-3蛋白水平比較

表4 正常對照組及白內障觀察組晶狀體上皮細胞凋亡率比較

2.4 白內障患者晶狀體上皮細胞中miR-126、caspase-3表達與晶狀體上皮細胞凋亡率的相關性 白內障患者晶狀體上皮細胞中miR-126、caspase-3表達與晶狀體上皮細胞凋亡率均呈顯著正相關(r=0.669，P<0.05；r=0.633，P<0.05)。見圖2、3。

圖2 白內障患者晶狀體上皮細胞中miR-126表達及其凋亡率的相關性分析

圖3 白內障患者晶狀體上皮細胞中caspase-3表達及其凋亡率的相關性分析

2.5 白內障患者晶狀體上皮細胞中miR-126、caspase-3表達的相關性 白內障患者晶狀體上皮細胞中miR-126水平與caspase-3表達水平顯著正相關(r=0.599，P<0.05)。見圖4。

圖4 白內障患者晶狀體上皮細胞中miR-126與caspase-3表達的相關性分析

3 討論

白內障是晶狀體衰老造成的，晶狀體是眼內一個無血管組織，具有屈光作用，能夠使眼球視物的焦點落到視網膜上。晶狀體由晶狀體囊及晶狀體纖維組成，在晶狀體與晶狀體囊之間有一單層上皮細胞即晶狀體上皮細胞，能夠分化成為晶狀體纖維，是晶狀體代謝活躍的細胞，上皮細胞的活性對晶狀體生長、分化、維持晶狀體的透明性及修復損傷有著至關重要的作用。研究表明，外部損傷、年齡老化及免疫代謝等均會使晶狀體上皮細胞活性降低，抗氧化能力下降，晶狀體內自由基含量隨之上升，使得晶狀體受到氧化損傷，影響晶狀體的正常代謝及其他生理功能，導致晶狀體渾濁，引發白內障，但其具體機制仍未明確[5]。隨著白內障患病率逐年上升，尤其在亞洲等發展中國家現象更為明顯，給社會造成極大負擔，因此探尋白內障發病機制，對診斷白內障疾病進程具有重要意義。

微小RNA(miRNA)是一類單鏈小分子非編碼RNA，具有負性調節靶基因的功能[6]。研究表明，miRNAs在眼部功能方面具有重要調控作用，影響晶狀體細胞增殖、分化、衰老等過程，與白內障等疾病進程密切相關[7]。已報道的miRNAs有miR-34、miR-125、miR-181、miR-184及miR-126等。季青山等[8]探究了miR-34a/SIRT1在H2O2誘導人晶狀體上皮細胞氧化應激中的表達情況，結果發現細胞氧化應激損傷可引起miR-34a表達水平上調，SIRT1表達水平下調。孫根柱等[9]研究表明miR-125a-3p在晶狀體上皮細胞凋亡中表達是下調的。可能與白內障的發病機制有關。秦宇等[10]探討了miR-181調控白內障晶狀體上皮細胞凋亡機制，結果表明miR-181能促進晶狀體上皮細胞凋亡，可能為白內障非手術治療提供新途徑。丁芝祥等[11]研究發現TGF-β2誘導人晶狀體上皮細胞轉分化時，細胞內miR-184表達上調，且表達水平與誘導濃度及時間有關。汪靜[12]探究了miR-126表達水平對人晶狀體上皮細胞凋亡的影響，結果發現miR-126可能通過調控HLEB3凋亡，從而在白內障治療中發揮作用。與過往研究一致的是，本研究結果發現白內障患者晶狀體上皮細胞中miR-126水平表達量較正常人顯著上調，提示miR-126可能與白內障的發病相關。

目前研究認為，白內障發病的首要環節是晶狀體上皮細胞凋亡，晶狀體上皮細胞是晶狀體內代謝最活躍的部位，它的凋亡會導致晶狀體上皮細胞密度降低，從而使晶狀體的正常生長受到影響[13]。此外晶狀體上皮細胞內含有大量酶系統，具有抗晶狀體氧化損傷、維持內環境穩定的作用。因此，晶狀體上皮細胞對于維持晶狀體透明十分重要。本研究發現，白內障患者晶狀體上皮細胞凋亡率高于正常人，提示晶狀體上皮細胞凋亡率可能與白內障疾病的發展相關。caspase-3是caspases半胱氨酸蛋白酶家族中的一員，又叫“殺手蛋白”，近年來研究人員發現caspase-3是細胞凋亡發生過程中的終末蛋白，在細胞凋亡中起著關鍵的作用，細胞經紫外線等物理、化學因素刺激后，caspase-3被激活，可使細胞中的細胞骨架等蛋白質成分降解，從而發生細胞凋亡[14]。研究表明，caspase-3能夠降解晶狀體連接蛋白，提示caspase-3的表達可能參與了白內障的形成[15]。鄭華峰等[16]研究了miR-126在大鼠心肌缺血再灌注早期的表達及作用，結果發現miR-126的與caspase-3的激活有關，從而影響了缺血心肌細胞的凋亡。Li等[17]研究發現caspase-3與TUG1均為miR-421的直接靶標，通過miR-421/caspase-3靶向調節晶狀體上皮細胞凋亡。這與本實驗有著相似之處，本研究結果發現觀察組晶狀體上皮細胞中caspase-3 mRNA和蛋白水平均顯著高于對照組，與李延輝等[18]人對于老年性白內障狀體上皮細胞凋亡及Caspase-3的表達情況研究一致，提示晶狀體上皮細胞凋亡及caspase-3的表達與白內障的發病機制有關。進一步分析顯示，白內障患者晶狀體上皮細胞中miR-126、caspase-3水平與細胞凋亡率顯著正相關，miR-126水平與caspase-3表達水平亦呈顯著正相關。提示miR-126與caspase-3可能通過某種機制共同參與調節晶狀體上皮細胞凋亡，進而影響白內障疾病的發生及發展。

綜上所述miR-126、caspase-3在白內障晶狀體上皮細胞中高表達，與晶狀體上皮細胞凋亡有關，提示二者可能通過調節晶狀體上皮細胞凋亡過程，參與白內障發病過程調控。