MTHFR基因多態性對宮頸癌吉西他濱新輔助化療的效果及預后影響

李雪梅 吳利瓊 張曉菊

宮頸癌(cervical cancer)是女性生殖道常見的惡性腫瘤，其發病趨勢近年來呈年輕化[1]。誘發因素包括經濟狀況、營養、婚育情況、病毒感染等，其中高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是宮頸癌病變的主要因素[2]。發展中國家宮頸癌發病率明顯高于發達國家，且由于發展中及低收入國家宮頸癌篩查率低于發達國家，使得宮頸癌致死率高于發達國家[3]。目前宮頸癌的治療根據FIGO分期不同而有差別[4]。新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy,NACT)為20世紀80年代興起的新治療手段，可用于局部晚期宮頸癌的治療[5]。吉西他濱(Gemcitabine)作為新型抗代謝抗癌藥，單獨或與其他抗腫瘤藥物聯用作為新輔助化療方案對多種腫瘤具有較好的療效[6]，在宮頸癌的新輔助治療中也取得良好療效[7，8]。然而臨床應用中仍有部分患者對吉西他濱化療具有耐藥性，從而降低了化療的療效及預后[9]。因此尋找合適的生物標記物評估患者預后，對宮頸癌個體化治療，臨床方案制定指導具有重要價值。亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是葉酸活化過程中起著重要作用的關鍵還原酶，有研究報道MTHFR單核苷酸多態性與多種腫瘤如乳腺癌、結腸癌、口腔鱗癌等的發生發展密切相關[10-12]。研究發現MTHFR基因多態性也與宮頸癌的發生密切相關，其中MTHFR1298和MTHFR667是宮頸癌患者常見的突變位點[13，14]。本文分析MTHFR1298和677兩位點基因多態性對宮頸癌患者經吉西他濱化療后療效及預后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年5月至2015年4月于我院就診接受吉西他濱化療的宮頸癌患者58例，搜集分析2組患者的年齡、分化程度等臨床病理資料。本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者對本研究知情且簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①患者經病理活檢確診為宮頸癌；②治療前患者未接受其他放化療；③年齡20～80歲；④臨床病病理資料完整。

1.2.2 排除標準：①合并其他惡性腫瘤的患者；②患有精神疾病或認知功能障礙的患者；③組織量不足而影響基因型分析的患者。

1.3 方法 患者均給予靜脈滴注吉西他濱(澤菲，江蘇豪森藥業股份有限公司)1 000 mg/m2，30 min滴注完畢，21 d為1個療程，共治療2個療程。每個療程結束后7～10 d對療效進行評估，如化療有效則繼續下1個療程的療效，如無效或進展者則根據病情行手術治療或放化療。

1.4 檢測方法 (1)石蠟組織DNA提取：根據石蠟包埋組織DNA提取試劑盒(寧波市重鼎生物技術有限公司)說明書流程提取DNA。(2)PCR擴增：根據不同引物的進行擴增，反應體系包括10 μl 2×Taq Master Mix，1 μl引物，0.4 μl探針，8.6 μl DNA。反應經40個循環，每個循環為95℃ 3 min，95℃ 12 s，62℃ 40 s，95℃ 12 s。(3)酶切反應：擴增后分別用限制性內切酶進行酶切反應，反應體系包括4 μl 5×Reation Buffer，1 μl限制性內切酶，6 μl PCR純化產物，9 μl高壓Free dH2O。其中MTHFR1298使用MboⅡ內切酶，MTHFR667使用HinfⅠ內切酶。(4)選取適合PCR產物大小的瓊脂糖凝膠濃度，將配置好的瓊脂糖溶于Tris/Borate/EDTA(TBE)緩沖液中，加熱使之澄清透明。待溶液冷卻后加入凝膠染料，隨后將凝膠溶液倒入膠膜，梳尺固定并取出凝膠后置于瓊脂糖凝膠電泳儀中，上樣，于150 V電壓下常溫跑電泳30 min，并用凝膠成像儀觀察結果。見表1。

1.5 近期療效評價 化療停止后根據實體瘤療效評價標準15對患者進行療效評價，療效分為4個等級：完全緩解(CR)： 腫瘤消失; 部分緩解(PR):腫瘤體積減小占比>30%；疾病穩定或無變化(SD)：腫瘤體積減小占比<30%或增大占比<20%；進展(PD)：腫瘤體積增大占比>20%；其中總有效率為CR+PR。

表1 PCR引物序列和限制性內切酶類型

1.6 隨訪 宮頸癌患者化療結束后分別于3個月、6個月1年來院復查，包括患者的陰道細胞學檢查、盆腔檢查、影像學及腫瘤標志物檢查。隨后進入生存隨訪階段，每3個月的電話隨訪，記錄患者的身體狀況及是否復發，患者死亡為隨訪終點。隨訪截止時間為2018年6月，末次隨訪仍存活的患者以結尾值計算，隨訪期間失訪以刪失處理。共3例患者失訪。

2 結果

2.2 MTHFR 1298A/C和667C/T基因型頻率 MTHFR 1298A/C位點的AA、AC、CC基因型頻率分別為46.5%、25.9%、27.6%；MTHFR 667C/T位點的CC、CT、TT基因型頻率分布為56.9%、29.3%、13.8%。見表2。

表2 MTHFR 1298A/C和667C/T基因型頻率 例(%)

2.3 MTHFR基因多態性與宮頸癌臨床病理特征的相關性 患者的年齡、病理類型、分化程度均及淋巴結轉移與MTHFR 1298和677兩位點的基因型無關，而患者的腫瘤分期僅與MTHFR 677位點的基因多態性相關(P=0.026)，與MTHFR 1298位點的基因多態性無關(P> 0.05)。見表3。

表3 MTHFR 1298和677基因多態性與臨床病理間的關系 例

2.4 MTHFR 1298和677基因多態性與近期療效間的關系 患者治療3個月時的療效顯示，總有效率為31.0%，進一步分析療效與MTHFR 1298和677位點基因多態性的相關性，患者接受吉西他濱化療后的短期療效與MTHFR兩位點的基因多態性均不相關(P>0.05)。見表4。

表4 MTHFR 1298和677基因多態性與近期療效間的關系 例

2.5 MTHFR 1298和677基因多態性與遠期療效間的關系 在隨訪過程中，有3例患者因更改聯系方式而失訪。剩余55例患者中，有22例患者在隨訪過程中因宮頸癌進展和復發而死亡，患者3年總體無病生存率為49.1%，總生存率為60%。患者死亡為隨訪終點，失訪患者為刪失數據(3例)。用Kaplan-Meier 單因素生存曲線分析宮頸癌患者無病生存率和總生存率與MTHFR 1298和677基因型分布情況、臨床病理參數間的關系，log-rank 檢驗分析患者各因素的統計學差異。宮頸癌患者無病生存率和總生存率與MTHFR 1298和677位點基因多態性及臨床病理間的關系分析顯示，MTHFR兩位點的基因多態性、臨床病理特征與患者的長期預后無顯著相關(P> 0.05)。見表5。

3 討論

由于宮頸癌具有較高的易感性，其在女性中的發病率一直居高不下，嚴重影響著患者的生活。放化療作為宮頸癌的主要治療方案，雖具有較好的療效，但仍有部分患者出現化療藥耐藥現象。吉西他濱作為去氧胞苷的類似物，可通過抑制核糖核苷還原酶而阻止DNA的修復和合成，進而抑制細胞復制，最終達到抗腫瘤的效果[15,16]。Swisher等[8]研究報道每周在順鉑和盆腔放療中加入低劑量的吉西他濱可提高療效。劉桂軍等[6]報道吉西他濱聯合順鉑新輔助化療非小細胞肺癌，可能誘導TXNIP 基因mRNA的表達，使TXNIP 蛋白表達水平上調，從而加強其對TrxR 的抑制，進而對硫氧還蛋白清除活性氧能力產生抑制了作用，最終達到腫瘤生長抑制作用。此外，胡旻等[7]通過使用吉西他濱聯合順鉑作為新輔助化療方案治療宮頸癌患者發現，該方案相較于系列霉素和順鉑化療方案具有更好的額臨床療效。而然而，近年來研究發現部分宮頸癌患者對吉西他濱具有耐藥性，該耐藥性與介導吉西他濱攝入的人平衡核苷轉運蛋白1(human Equilibrative Nucleoside Transporter 1，hENT1)有關，在耐細胞中(CaLoGR)hENT1表達下調[9]。

遺傳易染性作為宮頸癌發生的內源性因素，其與患者接受化療后的療效及預后可能相關。MTHFR作為葉酸代謝中不可或缺的酶，具有活化葉酸的功能。葉酸與腫瘤的發生息息相關，當葉酸攝入不足導致水平較低時，腫瘤發生率增加。其可能是因為體內低葉酸水平導致DNA中尿嘧啶的錯誤插入和基因組DNA的低甲基化，進而導致基因組的不穩定性和腫瘤的發生[17]。MTHFR常見的基因多態性有1298A/C和677C/T兩種，研究顯示，MTHFR 677位點C突變到T，或1298位點A突變到C時，DNA甲基化、合成及修復受阻，從而可能成為宮頸癌發生的易感因素[18]。基于此，本文對MTHFR基因多態性及其與吉西他濱化療療效及預后的相關性做了分析。研究結果顯示，MTHFR 1298A/C位點的AA、AC、CC基因型頻率分別為46.5%、25.9%、27.6%；MTHFR 667C/T位點的CC、CT、TT基因型頻率分布為56.9%、29.3%、13.8%。MTHFR 1298A/C位點和677C/T位點基因多態性與臨床病理關系分析顯示僅MTHFR 667C/T的基因多態性與患者腫瘤分期相關，而MTHFR 1298A/C位點和677C/T位點與患者的年齡、病理類型、分化程度及淋巴結轉移均無顯著相關(P> 0.05)。Jae等[19]報道當MTHFR 667C/T位C突變到T時，其編碼的丙氨酸將被纈氨酸替代，從而降低MTHFR催化活性，影響葉酸的正常生理功能，從而引發DNA甲基化異常和DNA修復受阻，最終導致腫瘤惡化，臨床分期升高。與本文結果一致，提示MTHFR 667C/T位點的基因多態性為腫瘤分期的判別提供了參考。

表5 MTHFR 1298和677基因多態性及臨床病理與生存率間的相關性 例(%)

進一步分析MTHFR 1298A/C位點和677C/T位點與吉西他濱化療療效和預后的關系表明，MTHFR兩位點的基因多態性與近、遠期療效均不相關。MTHFR的多態性與腫瘤發生、進展間的關系是當前的研究熱點，然而其與腫瘤間的相關性仍無明確定論。Nemah Awwad等[20]報道MTHFR 677C/T位點的基因多態性與乳腺癌的發生相關，而1298A/C位點與乳腺癌無關。Gonzales等[21]則表明MTHFR 677C/T和1298A/C位點基因多態性對乳腺癌易染性的影響因地區而異，在澳洲、東亞、中東、南歐、摩洛哥和美國MTHFR 677 TT突變型可導致較高的乳腺癌發病率，而在亞洲、中東、南歐、南美等地則MTHFR 1298 CC突變型對乳腺癌的易染性影響較大。MTHFR基因型對宮頸癌的影響與之類似，Gong等[14]發現MTHFR 677位點的基因多態性與宮頸癌的發生無關，1298位點的基因多態性則與宮頸癌密切相關。然而，Lambropoulos等[22]卻闡明MTHFR 677位點基因多態性與宮頸癌病變無關。該差異可能與所選擇的地區、人種有關。

綜上所述，MTHFR 1298和677位點的基因多態性與宮頸癌患者接受吉西他濱治療后的療效及預后均無顯著相關性。但本文仍存在樣本數較少，取樣多樣性欠缺等局限，故需大樣本、多地區、多民族、長期試驗進行驗證。