缺氧誘導的miRNA-210靶向HIF-1α促進胃癌發(fā)展機制研究

賈國炳

胃癌起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，在全球惡性腫瘤中發(fā)病率第四位，在中國占首位，40%患者確診時胃癌已發(fā)生轉移[1]，嚴重影響患者生命安全。腫瘤生長需要氧氣的供應，但隨著實體瘤的生長，多種結構異常導致腫瘤組織中氧分壓低于正常組織[2]。低氧微環(huán)境是實體瘤的常見特征，低氧時最先刺激低氧誘導因子(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)過表達，進而促進細胞增殖和遷移[3]。同時低氧時多種微小RNA(microRNA，miRNA)表達異常，miR-210是缺氧誘導的miRNA之一，缺氧時在胃癌組織中高表達，與胃癌組織的發(fā)生、發(fā)展有關[4]。但miR-210與HIF-1α在低氧條件下對胃癌細胞的影響尚不明確。因此本研究以人胃癌細胞系SGC-7901為研究對象，檢測低氧條件下miR-210和HIF-1α的變化與細胞增殖、遷移的關系，為尋找新的胃癌靶基因位點提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞:人胃癌細胞SGC-7901購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 主要試劑：氯化鈷(CoCl2)購自蘇州斌順化工有限公司，貨號：7646-79-9。RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、Trizol均購自美國ThermoFisher公司。CCK-8試劑盒、蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒、PVDF膜均購自碧云天生物科技有限公司，貨號分別為：C0037、P0033、P0012S、FFP32。miRVana miRNA提取試劑盒購自美國Ambion公司。2×Hi SYBR Green QPCR Mix購自日本TaKaRa公司，貨號：ARR041A。一抗HIF-1α(抗鼠)、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)(抗兔)、胰島素樣生長因子Ⅱ mRNA結合蛋白3(insulinlike growth factorⅡ mRNA-binding protein 3，IMP3)(抗兔)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)(抗兔)、內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(抗兔)均購自美國Abcam公司，克隆號分別為：H1alpha67、EPR3821、EPR12021、E247、EPR16891。脫脂奶粉購自美國BD公司。二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)顯色試劑購自索來寶科技有限公司。antagomic miR-210試劑購自廣州銳博生物科技有限公司，引物由上海生工生物公司合成。

1.1.3 儀器：CO2培養(yǎng)箱購自德國WIGGENS公司，型號：WCI-180。酶標儀購自美國BIO-RAD公司，型號：550。Transwell小室購自美國Costar公司，型號：3421。普通光學顯微鏡購自美國Olympus 公司，型號：XK-SW002。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀購自美國ABI公司，型號：7500。蛋白凝膠成像儀購自上海Tanon公司，型號：5200。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與處理：①細胞培養(yǎng)：RPMI1640培養(yǎng)基中加10%FBS制成完全培養(yǎng)基，4℃冰箱保存待用。SGC-7901從液氮中取出，37℃水浴鍋中復蘇，10 ml離心管中加8 ml RPMI1640完全培養(yǎng)基，SGC-7901加入其中去除DMSO。RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸SGC-7901置CO2培養(yǎng)箱(5%CO2，37℃)中常規(guī)培養(yǎng)，傳2～3代后收集對數(shù)生長期細胞進行實驗。②細胞處理：生長良好的SGC-7901接種于6孔細胞板中，待密度至60%時RPMI1640完全培養(yǎng)基稀釋CoCl2，制成CoCl2終濃度分別為0、100、150、200、300 μmol/L，RPMI1640完全培養(yǎng)基分別加入培養(yǎng)孔中，作用3 h后更換為RPMI1640完全培養(yǎng)基進行后續(xù)實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖能力:1.2.1處理過的細胞接種至96孔板(5.0×104個/孔)，RPMI1640完全培養(yǎng)基為空白對照，每孔100 μl，6個重復。置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，加入CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標儀檢測450 nm下各孔細胞光密度(optic density，OD)，OD450=實驗孔OD450-空白對照孔OD450。

1.2.3 Transwell實驗檢測細胞遷移能力：Transwell置于24孔板中，每孔加1 ml只含RPMI1640的培養(yǎng)基置于CO2培養(yǎng)箱平衡1 h，取出小室風干備用。新的24孔板每孔加500 μl RPMI1640完全培養(yǎng)基，1.2.1處理過的細胞用只含RPMI1640的培養(yǎng)基制成懸液接種于Transwell小室上層(3×103個/孔)，整個過程無菌操作。置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取出Transwell小室，置于0.1%結晶紫中染色5 min，清洗多余結晶紫后光學顯微鏡下拍照并計數(shù)發(fā)生遷移的細胞數(shù)量。

1.2.4 qRT-PCR檢測細胞中miR-210水平:1.2.1處理過的細胞接種至6孔板中加RPMI1640完全培養(yǎng)基，待細胞密度至80%～90%時做qRT-PCR實驗。每個孔中加1 ml Trizol裂解細胞并提總RNA，100 ng miRVana miRNA提取試劑盒提取cDNA，qRT-PCR儀對miR-210、內(nèi)參U6擴增。引物序列：hsa-miR-210-F：5’-ATGTTGGCCCTGGTGA-3’，hsa-miR-210-R：5’-TGGCTGTGTAGGGTCG-3’；hsa-U6-F：5’-TGCTGGGGCTTTCCGGCAGCGC-3’，hsa-U6-R：5’-CCCAGTGAGGTCCGGAGGT-3’。上樣體系：cDNA 1 μl，F(xiàn)/R(10 μmol/L)各0.5 μl，2×Hi SYBR Green QPCR Mix 10 μl，ddH2O 8.0 μl。反應條件：95℃、5 min；95℃、10 s，58℃、25 s，45個循環(huán)。2-ΔΔCT法計算細胞中miR-210水平。

1.2.5 蛋白免疫印跡(western blot，WB)檢測細胞中HIF-1α、PCNA、IMP3、β-catenin蛋白表達:按1.2.4操作，待細胞密度至80%～90%時做WB實驗。蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白總濃度，處理蛋白使每孔總蛋白濃度相同。每孔上樣30 ng，PAGE膠分離蛋白質(zhì)，PVDF膜280 mA 45 min轉膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；對應加入一抗HIF-1α(1∶400)、PCNA(1∶1 000)、IMP3(1∶2 000)、β-catenin(1∶5 000)、GADPH(1∶10 000)4℃孵育過夜；對應加入二抗，室溫孵育1 h。DAB顯色試劑顯色，蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

1.2.6 細胞轉染:細胞處理后接種于6孔板，待密度至80%更換為只含RPMI1640的培養(yǎng)基。LipofectamineTM3000法轉染，按照試劑盒說明書操作。分為miR-210陰性對照(antagomic NC)組和miR-210抑制(antagomic miR-210)組，分別轉染終濃度為100 nmol/Lantagomic NC和antagomic miR-210，另設不轉染組作為對照。轉染6 h后觀察細胞形態(tài)，更換為RPMI1640完全培養(yǎng)基。置CO2培養(yǎng)箱中48 h后WB檢測HIF-1α蛋白表達。

2 結果

2.1 不同缺氧濃度下胃癌細胞SGC-7901增殖情況 與0 μmol/L CoCl2組比較，100、150、200、300 μmol/L CoCl2組OD450升高(P<0.05)；與100 μmol/L CoCl2組比較，150、200、300 μmol/L CoCl2組OD450升高(P<0.05)；與150 μmol/L CoCl2組比較，200、300 μmol/L CoCl2組OD450升高(P<0.05)；與200 μmol/L CoCl2組比較，300 μmol/L CoCl2組OD450升高(P<0.05)。見表1。

表1 不同缺氧濃度下胃癌細胞SGC-7901增殖情況比較

注：與0 μmol/L CoCl2組比較，*P<0.05；與100 μmol/L CoCl2組比較，#P<0.05；與150 μmol/L CoCl2組比較，△P<0.05；與200 μmol/L CoCl2組比較，☆P<0.05

2.2 不同缺氧濃度下胃癌細胞SGC-7901遷移情況 與0 μmol/L CoCl2組比較，其余4組遷移細胞數(shù)量升高(P<0.05)；與100 μmol/L CoCl2組比較，150、200、300 μmol/L CoCl2組遷移細胞數(shù)量升高(P<0.05)；與150 μmol/L CoCl2組比較，200、300 μmol/L CoCl2組遷移細胞數(shù)量升高(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 不同缺氧濃度下胃癌細胞SGC-7901遷移情況比較(結晶柴染色×200)

表2 不同缺氧濃度下胃癌細胞SGC-7901遷移個數(shù)比較

注：與0 μmol/L CoCl2組比較，*P<0.05；與100 μmol/L CoCl2組比較，#P<0.05；與150 μmol/L CoCl2組比較，△P<0.05；與200 μmol/L CoCl2組比較，☆P<0.05

2.3 miR-210在不同缺氧濃度下胃癌細胞SGC-7901中的表達 與0 μmol/L CoCl2組比較，100、150、200、300 μmol/L CoCl2組miR-210表達水平升高(P<0.05)；與100 μmol/L CoCl2組比較，150、200、300 μmol/L CoCl2組miR-210表達水平升高(P<0.05)；與150 μmol/L CoCl2組比較，200、300 μmol/L CoCl2組miR-210表達水平升高(P<0.05)；與200 μmol/L CoCl2組比較，300 μmol/L CoCl2組miR-210表達水平升高(P<0.05)。見表3。

表3 miR-210在不同缺氧濃度下胃癌細胞SGC-7901中表達水平比較

注：與0 μmol/L CoCl2組比較，*P<0.05；與100 μmol/L CoCl2組比較，#P<0.05；與150 μmol/L CoCl2組比較，△P<0.05；與200 μmol/L CoCl2組比較，☆P<0.05

2.4 HIF-1α在不同缺氧濃度下胃癌細胞SGC-7901中的表達 與0 μmol/L CoCl2組比較，150、200、300 μmol/L CoCl2組HIF-1α表達水平升高(P<0.05)；與100 μmol/L CoCl2組比較，150、200、300 μmol/L CoCl2組HIF-1α表達水平升高(P<0.05)；與150 μmol/L CoCl2組比較，200、300 μmol/L CoCl2組HIF-1α表達水平升高(P<0.05)。見圖2，表4。

圖2 HIF-1α在不同缺氧濃度下胃癌細胞SGC-7901中的表達比較

2.5 不同缺氧濃度下胃癌細胞SGC-7901中PCNA、IMP3、β-catenin的表達 與0 μmol/L CoCl2組比較，100 μmol/L CoCl2組PCNA、β-catenin，150、200、300 μmol/L CoCl2組PCNA、IMP3、β-catenin表達水平升高(P<0.05)；與100 μmol/L CoCl2組比較，150 μmol/L CoCl2組IMP3、β-catenin，200、300 μmol/L CoCl2組PCNA、IMP3、β-catenin表達水平升高(P<0.05)；與150 μmol/L CoCl2組比較，200 μmol/L CoCl2組PCNA、IMP3，300 μmol/L CoCl2組PCNA、IMP3、β-catenin表達水平升高(P<0.05)；與200 μmol/L CoCl2組比較，300 μmol/L CoCl2組β-catenin表達水平升高(P<0.05)。見圖3,表5。

表4 HIF-1α在不同缺氧濃度下胃癌細胞SGC-7901中的表達水平比較

注：與0 μmol/L CoCl2組比較，*P<0.05；與100 μmol/L CoCl2組比較，#P<0.05；與150 μmol/L CoCl2組比較，△P<0.05；與200 μmol/L CoCl2組比較，☆P<0.05

圖3 不同缺氧濃度下胃癌細胞SGC-7901中增殖蛋白PCNA、IMP3、β-catenin的表達

表5 在不同缺氧濃度下胃癌細胞SGC-7901中增殖蛋白PCNA、IMP3、β-catenin水平比較

注：與0 μmol/L CoCl2組比較，*P<0.05；與100 μmol/L CoCl2組比較，#P<0.05；與150 μmol/L CoCl2組比較，△P<0.05；與200 μmol/L CoCl2組比較，☆P<0.05

2.6 miR-210可靶向調(diào)控HIF-1α基因 Targetscan預測結果顯示，HIF-1α基因3’UTR區(qū)有與miR-210結合位點。低氧條件下轉染antagomic miR-210和其對應NC，與0 μmol/L CoCl2組比較，200 μmol/L CoCl2組和200 μmol/L+antagomic NC組細胞中HIF-1α表達水平升高(P<0.05)。200 μmol/L CoCl2組和200 μmol/L CoCl2+antagomic NC組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與200 μmol/L CoCl2組、200 μmol/L CoCl2+antagomic NC組比較，200 μmol/L CoCl2+antagomic組細胞中HIF-1α表達水平降低(P<0.05)。見圖4，表6。

3 討論

胃癌在中國屬高發(fā)癌癥，發(fā)病率、死亡率分別占全球胃癌發(fā)病和死亡的42.6%、45%，治療花費大且復發(fā)率高，給家庭帶來沉重的負擔[5]。胃癌復發(fā)和死亡率高的主要原因是胃癌細胞具有轉移能力，低氧微環(huán)境是其中一個誘因。研究發(fā)現(xiàn)低氧誘導肺動脈成纖維細胞、平滑肌細胞的增殖、遷移和肺血管的重構[6,7]。CoCl2已被應用于制備缺氧模型，能夠產(chǎn)生與機體相似的缺氧反應[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著CoCl2濃度的升高，胃癌細胞SGC-7901 OD450、遷移細胞數(shù)量升高；提示細胞缺氧程度越嚴重，細胞增殖、遷移速度越快，加重胃癌進程。

圖4 HIF-1α基因與miR-210結合位點預測

表6 HIF-1α在胃癌細胞SGC-7901不同處理中的表達比較

注：與0 μmol/L CoCl2組比較，*P<0.05；與200 μmol/L CoCl2組比較，#P<0.05；與200 μmol/L CoCl2+NC組比較，△P<0.05

miRNA是一段長18～24個氨基酸的內(nèi)源性非編碼RNA，能與靶基因mRNA3’非編碼區(qū)特異性結合，調(diào)節(jié)基因轉錄和表達，在細胞增殖、轉移、分化及凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[9]。miR-210在缺氧環(huán)境中可調(diào)控細胞周期、促進干細胞代謝、抑制線粒體代謝、抑制DNA修復、誘導血管生成、支持細胞分化等，加重疾病進程[10]。在缺氧心肌細胞中miR-210表達上調(diào)會加重細胞損傷，抑制miR-210的表達會減弱心肌細胞的損傷[11]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著CoCl2濃度的升高，胃癌細胞SGC-7901細胞系中miR-210表達量升高；提示缺氧越嚴重，越促進miR-210的表達，可能是與相關靶位點結合促進細胞增殖、轉移，從而加快疾病進程。

HIF-1α是低氧時最先刺激的因子，低氧刺激可促HIF-1α過表達使細胞適應低氧環(huán)境，可結合或活化靶基因上共同結合位點5’-RCGTG-3’在腫瘤過程中發(fā)揮血管生成、細胞增殖、代謝、侵襲和轉移、化學治療耐受、免疫逃逸等作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著CoCl2濃度的升高，胃癌細胞SGC-7901細胞系中HIF-1α表達量逐漸升高；提示缺氧越嚴重，低氧誘導因子HIF-1α表達量越高，低氧刺激HIF-1α的表達，加重反應進程。

PCNA是反映細胞增殖能力的指標、IMP3調(diào)節(jié)胰島素樣生長因子2的表達促進腫瘤增殖，而胰島素樣生長因子2是HIF-1α的靶基因之一[13]。β-catenin參與細胞增殖、遷移、凋亡和血管生成，在缺血性微環(huán)境中HIF-1α/β-catenin/TCF3/LEF1信號通路中促進β-catenin分泌來促進血管生成[14]。本研究發(fā)現(xiàn)隨CoCl2濃度升高，胃癌細胞SGC-7901細胞系中PCNA、IMP3、β-catenin表達量明顯升高，提示細胞中影響細胞增殖、遷移蛋白表達量升高，可能是HIF-1α影響增殖、遷移蛋白的表達進而促進胃癌發(fā)生、發(fā)展。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-210可與多個靶基因結合影響缺氧條件下細胞功能，在缺氧條件下抑制靶基因內(nèi)皮素-2進而影響排卵和黃體生成[15]；抑制干擾素調(diào)節(jié)因子4導致骨髓瘤細胞抗凋亡[16]。HIF-1α是miR-210潛在靶基因，缺氧條件下抑制miR-210的表達HIF-1α表達水平降低。以往研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α是miR-210靶基因[17]，提示miR-210、HIF-1α作為缺氧刺激因子，直接作用相互影響促進下游細胞增殖、遷移蛋白的表達從而促進細胞增殖、遷移，加重疾病進程。

綜上所述，miR-210在胃癌細胞中通過上調(diào)HIF-1α表達促進細胞的增殖和遷移，表明miR-210可作為潛在靶標應用于胃癌基因治療。下一步可在缺氧條件下熒光素酶驗證miR-210與HIF-1α的靶向關系，并探討降低miR-210表達對胃癌細胞的影響。