DK-β、Lgr5和mTOR/P70s6k在胃癌中的表達及對預后的預測價值

付漢東 寇繼光 劉漢中 陽仕雄 張愛華 胡校云 沈婷 魏威

胃癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，美國癌癥協會(ACS)在2014年胃癌的發病率與死亡率的相關研究指出，雖然整體的胃癌的死亡率有下降[1]，但是胃癌的發病率呈現上升的趨勢，全世界每年大約有近90萬人死于胃癌相關疾病[2]。胃癌的高發率與近年人們飲食習慣、環境因素、遺傳因素等都有一定的關系。目前臨床對于胃癌的治療手段包括手術根治術、放化療、基因靶向藥物治療等，但是胃癌發病早期患者不重視，大多數確診患者均為中晚期，已經錯過最佳的手術時間。近年靶向藥物治療成為研究熱點，而靶向藥物治療針對主要有以下幾個藥物作用靶點：G 蛋白耦聯受體5是富含亮氨酸重復系列(Leucine-rich repeat G protein-coupledreceptor 5，Lgr5)，是干細胞分子標志物，在Wnt信號通路起到靶基因作用，臨床其特性具有較強的自我更新能力[3]；雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一種對細胞的生長、增殖非常關鍵的調節分子，同時在激活后的mTOR蛋白，對p70S6激酶(P70S6kinase,p70S6K)有磷酸化作用，對肌動蛋白的細胞遷移，細絲重構有推動作用[4]；Dermokine(DK)是上皮細胞角化后分泌的一種多肽，主要為縮氨酸，目前研究顯示DK至少有13種不同的亞型，DK-β是其中一種[5]。本研究通過收集胃癌患者癌組織和癌旁組織樣本，檢測上述靶向藥物作用相關靶點蛋白，探討這些蛋白的表達與胃癌發生、發展以及治療預后的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年6月至2018年6月收治的85例胃癌患者為研究對象，并選取同期80例非胃癌的患者為對照組，2組患者的基本信息比較差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：胃癌患者均術前實施胃鏡檢查并取病理組織確診，術后留取癌組織以及癌旁組織；胃癌患者實施手術治療前未經化療、放療等相關干預手段；術前無其他相關臟器原發性腫瘤；研究對象均知情且同意；患者病歷資料完整；經醫院倫理委員會同意。

1.2.2 排除標準：患者術前經相關治療；伴有其他臟器嚴重病變疾??；妊娠、哺乳期女性。

1.3 方法

1.3.1 標本收集:胃癌患者均經胃鏡及病理組織確診并實施手術治療的患者，取患者胃癌組織及癌旁組織(距病灶邊緣>5 cm位置)為標本，同時對對照組患者在胃鏡檢查時采集的胃黏膜正常組織為標本；以上所有病理組織在-80℃保存。

1.3.2 儀器與試劑:反轉錄試劑盒，總RNA提取試劑盒，基因試劑盒，瓊脂糖，Taq DNA聚合酶，兔抗人mTOR,Lgr5,P70s6k,DK-β多克隆抗體,羊抗兔IgG，生物組織快速脫水儀，顯微鏡，凝膠成份分析儀，高速低溫離心機，乙醇等。

1.3.3 方法：實施Trizol方法對組織RNA提取，然后進行擴增和電泳，進行RT-PCR指標檢測。采用免疫組織化學Envision法進行檢測DK-β、Lgr5和mTOR/P70s6k在胃癌中的表達。

1.4 觀察指標 RT-PCR法對DK-β、Lgr5、mTOR、P70s6k在不同病理組織的相對表達情況比較；DK-β、Lgr5、mTOR、P70s6k在3組組織中的表達情況，與胃癌患者臨床特征關系以及患者生存評估。

1.5 判定指標 DK-β染色陽性為細胞核染色，顏色反應深黃色、棕褐色，背景藍色，顆粒狀；Lgr5染色陽性為細胞核染色，顏色深黃色，棕褐色；mTOR染色陽性為細胞質染色，顏色深黃色、棕褐色；P70s6k染色陽性為細胞質或者細胞核染色，顏色反應深黃色、棕褐色[6]。隨機選取每隔染色片10各視野進行陽性細胞率的計算，染色氣強度記錄淺黃色為1分，黃色為2分，深黃色、棕褐色為3分；陽性細胞百分比記錄，<25%為1分，25%～50%為2分，51%～70%為3分，>70%為4分；染色輕度與陽性細胞百分比<2分為陰性(-)，2～4分為(+)，5～6分為(++)，>6分為(+++)[7]。

2 結果

2.1 RT-PCR方法對DK-β、Lgr5、mTOR、P70s6k在不同病理組織的相對表達情況分析 DK-β、Lgr5、mTOR、P70s6k在胃癌組織中的相對表達指標明顯高于癌旁組織及其對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。DK-β、Lgr5、mTOR、P70s6k在不同病理組織的相對表達情況呈正相關性(P<0.05)。見表1，圖1。

2.2 DK-β、Lgr5、mTOR、P70s6k在3組蛋白中的陽性表達情況比較 Lgr5、mTOR/P70s6k在3組組織中的陽性表達胃癌組織陽性率，明顯高于癌旁組織以及對照組；3組組織中，DK-β陽性率的表達中癌旁組織的陽性率較胃癌組織以及對照組比顯著增高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 RT-PCR對DK-β、Lgr5、mTOR、P70s6k的m-RNA在胃癌中表達相對表達情況比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與癌旁組織比較，#P<0.05

圖1 DK-β、Lgr5、mTOR/P70s6k在胃癌組織、癌旁組織、正常組織中的表達;A、B、C是DK-β在胃癌組織、癌旁組織、正常組織中的表達；D、E、F是Lgr5胃癌組織、癌旁組織、正常組織中的表達；G、H、J是mTOR/P70s6k在胃癌組織、癌旁組織、正常組織中的表達(HE×400)

表2 DK-β、Lgr5、mTOR、P70s6k在3組蛋白中的陽性表達情況比較 例(%)

注：與對照組比較，*P<0.05；與癌旁組織比較，#P<0.05

2.3 DK-β、Lgr5、mTOR/P70s6k在胃癌中的陽性表達與胃癌患者臨床特征關系 DK-β、Lgr5、mTOR/P70s6k的陽性表達與胃癌患者年齡、性別灌洗比較差異無統計學意義(P>0.05)。DK-β在胃癌患者腫瘤直徑大小陽性率的表達差異無統計學意義(P>0.05)。Lgr5、mTOR/P70s6k陽性率的表達在胃癌患者腫瘤直徑<5 cm(60.41%，58.33%，56.52%)與直徑≥5 cm的陽性率(86.48%，75.68%，72.97%)比較差異有統計學意義(P<0.05)。DK-β、Lgr5、mTOR/P70s6k在TNM分期，組織學分級，淋巴轉移情況比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

2.4 DK-β、Lgr5、mTOR/P70s6k不同陽性表達強度與患者生存分析 Lgr5、mTOR/P70s6k的高表達患者的3年生存率以及生存時間較低表達比較差異有統計學意義(P<0.05)。DK-β在對患者預后的評估高表達與低表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表3 DK-β、Lgr5、mTOR/P70s6k的陽性表達與胃癌患者臨床特征關系 例(%)

表4 DK-β、Lgr5、mTOR、P70s6k不同陽性表達強度與患者生存分析

3 討論

胃癌疾病發展過程中其胃黏膜的上皮角化細胞排列緊密，且細胞之間嵌合，通過橋粒建立細胞間的連接，而細胞的排列的間隙則是膜被顆粒的排出物進行填充，起到保護的作用，組織有害物質侵入；但是胃黏膜的生物學的獨特性，在受到損傷后，發生潰瘍，并逐漸發生癌變[8]。

胃黏膜的癌變是一個漫長的過程，是一步步發展,最終成為惡性腫瘤；在潰瘍炎性反應的造成細胞分化增生等過程中，APC基因，RAS基因的監控機制會被打破，所以角化細胞分泌DK-β的指標就會增加[9]；本次研究中，在低表達中更顯著，且發生淋巴轉移的表達中明顯高于未發生轉移的，所以對于DK-β的檢查中可以對胃癌患者早期的病變有了解，對早期的篩選診斷具有積極的意義；但是對預后生存評估并沒有明顯的提示性。

Lgr5 是Wnt 信號通路的靶基因，是最近研究中發現的干細胞標志物，對腫瘤的轉移，分期等具有可以作為主要的觀察指標，在多種惡性腫瘤中，如結腸癌、宮頸癌等的相關研究中有高表達[10]。相關臨床研究中，對食管組織實施免疫組化而發現Lgr5 表達情況顯示，Lgr5 表達越高患者生存率越低。

mTOR/P70s6k的信號傳導具有調節機體細胞正常代謝以及機體生長過程中的重要信號通道，在多種腫瘤組織中都可以發現，具有非常重要的位置。mTOR蛋白的結構分子主要包括包含靠近N末端heat結構亞基，介導某些蛋白一蛋白之間的相互作用，證實FAT結構亞基能夠穩定mTOR的蛋白活性[11]。同時在激活后的mTOR蛋白，對p70S6激酶(P70S6kinase,p70S6K)有磷酸化作用，對肌動蛋白的細胞遷移，細絲重構有推動作用。通過對其深入的研究發現在腫瘤的表達中具有的信號傳導、表達不斷認知，其高表達與低表達對腫瘤患者的生存預估具有較高的預測價值。

本研究結果顯示胃癌組織DK-β、Lgr5、mTOR、P70s6k的相對表達指標明顯高于癌旁組織及對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。3組組織中DK-β、Lgr5、mTOR/P70s6k的m-RNA相關性比較呈正相關性(P<0.05)。3組組織的Lgr5、mTOR/P70s6k的胃癌組織陽性率的表達，明顯高于癌旁組織以及對照組；3組組織中的DK-β陽性率的表達，其中癌旁組織的陽性率較胃癌組織以及對照組比顯著增高，差異有統計學意義。DK-β、Lgr5、mTOR、P70s6k的陽性表達與胃癌患者年齡、性別比較差異無統計學意義(P>0.05)。DK-β在胃癌患者腫瘤直徑大小陽性率的表達差異無統計學意義(P>0.05)。Lgr5、mTOR/P70s6k在胃癌患者腫瘤直徑大小陽性率的表達<5 cm為(60.41%，58.33%，56.52%)與直徑≥5 cm陽性率(86.48%，75.68%，72.97%)比較差異有統計學意義(P<0.05)。DK-β、Lgr5、mTOR/P70s6k在TNM分期，組織學分級，淋巴轉移情況比較差異有統計學意義(P<0.05)。說明DK-β、Lgr5和mTOR/P70s6k在胃癌中的表達中對患者的腫瘤TNM分期，組織學分級，淋巴轉移情況有密切的關系。

綜上所述，Lgr5和mTOR/P70s6k的高、低表達對患者的預后生存情況有一定的預測評估價值，DK-β則可以作為早期的篩查手段，對患者早期血清中的檢測可以進行篩選；以上指標對胃癌患者的篩查、胃癌的進展以及預后診斷多方面具有重要的應用價值。