姜黃素-聚甲基丙烯酸甲酯納米粒子的制備及對肺癌A549細胞的影響

單秋杰，詹小蘭，李玉

(浙江省榮軍醫院藥劑科，嘉興 314000)

近年來，納米材料應用于癌癥治療取得了顯著進展[1-2]。肺癌是我國癌性死亡的主要原因之一，其發病率和病死率也已經躍居各種惡性腫瘤首位[3]。研究報道已有多種天然產物用于治療癌癥，其中姜黃素(curcumin，Cur)可預防膀胱癌、軟腭癌、胃腸道癌、子宮頸癌、肺癌和皮膚癌等的癌前病變，并已證實其與惡性腫瘤的治療反應有關[4]。然而，由于姜黃素的低水溶性和低生物利用度等缺點導致其療效并不理想[5]。為了提高姜黃素的治療和預防作用，設計先進的藥物輸送系統，如納米載體輸送，具有疏水核心及親水外殼的納米載體有助于疏水藥物的溶解和安全制備[6]。研究表明納米粒子(nanoparticles，NPs)在不同類型的腫瘤治療中發揮作用[5，7]。在不同類型的疏水性聚合物中，具有生物相容性的聚甲基丙烯酸甲酯(poly methyl methacrylate，PMMA)由于其耐化學水解、非手性、藥物高滲透性和無毒性等而被廣泛應用于藥物遞送[8]。本研究采用微乳液聚合法制備PMMA NPs，并用生物粘附聚合物聚丙烯酸(poly acrylic acid，PAA)對Cur-PMMA NPs的表面進行功能化，評估功能化Cur-PMMA NPs對肺癌A549細胞的藥物攝取和細胞活性。

1 材料與方法

1.1材料 PMMA(P141444)、PAA(P131657)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS，S108347)、2，2′-偶氮二異丁腈(2，2′-azo diisobutyronitrile，AIBN，A104255)和姜黃素(C110685)購自阿拉??；噻唑藍(tertrazolium blue，MTT)購自碧云天生物技術公司(C0009)；人肺腺癌A549細胞系購自于中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫。

1.2姜黃素-PMMA NPs的制備及功能化 PMMA NPs采用微乳液聚合法制備，NPs 在恒定攪拌和70 ℃氮氣保護條件下進料，將AIBN 26.6 mg和SDS7.766 mg混合加入含超純水20 mL的三頸圓底燒瓶中，逐滴加入PMMA，并保持上述反應參數過夜進行聚合過程，生成NPs。用N，N-二甲基甲酰胺為溶劑配制濃度為1.0 mmol·L-1的姜黃素溶液，將PMMA NPs用超純水稀釋10倍，取2 mL置于透析膜中，逐漸加入姜黃素，直到膜袋外測得姜黃素。從420 nm波長的紫外-可見光吸收峰中估算出姜黃素的含量，用于確定載藥率和包封率，公式如下：

NPs中姜黃素的Wt=加入總姜黃素的Wt-游離姜黃素的Wt

輕微攪拌NPs，添加0.01%PAA來對姜黃素 NPs進行表面功能化，并在25 ℃下保持4 h。

1.3特性檢測 采用電位分析儀ZS90(Malvern儀器有限公司，Malvern，英國)，掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM，德國Zeiss，Oberkochen)，透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy，TEM)和傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR；RX1，珀金埃爾默股份有限公司)對PMMA NPs、Cur-PMMA NPs和PAA-Cur-PMMA NPs進行動態光散射(dynamic light scattering，DLS)。

為了比較Cur-PMMA-NP在不同介質中的體外釋放率，在falcon試管中，將Cur-PMMA-NP 1.5 mL分別添加到1.5 mL PBS(pH值 7.4)、0.9%氯化鈉溶液和胎牛血清中，并在37 ℃下孵化10 d，對藥物釋放情況進行檢測。根據設定時間點，將樣品以3000 r·min-1離心，棄去上清液，將姜黃素溶于乙醇3 mL中，記錄420 nm波長處的吸光度。

為了判斷A549細胞系的藥物攝取，將5組細胞(對照組、PMMA- NPs組、游離姜黃素組、Cur-PMMA NPs組和PAA-Cur-PMMA NPs組)置于6孔組織培養板中的蓋玻片上，并在37 ℃下孵育培養到一定密度，然后將它們暴露于50 μg·mL-1的尼羅紅標記的PMMA NPs下，用熒光顯微鏡觀察尼羅紅標記的PMMA- NPs和PAA-PMMA NPs。

1.4體外抑制腫瘤細胞 MTT法檢測姜黃素，PMMA NPs，Cur-PMMA NPs和PAA-Cur-PMMA NPs對A549細胞活性的影響。將每孔2×103個細胞接種在96孔板中，并用12.5，25，50和100 μg·mL-1濃度的姜黃素和含等劑量姜黃素的Cur-PMMA NPs和PAA-Cur-PMMA NPs進行處理。在24，48和72 h時，估算與未處理的對照細胞相比的細胞抑制率。

2 結果

2.1NPs表征 通過DLS證實，PMMA NPs和Cur-PMMA NPs的粒徑為(192.66±5.00)和(199.16±9.00) nm，且沒有發生聚集。PAA-Cur-PMMA NPs的粒徑為(205±7.00) nm，PMMA NPs中姜黃素的相應載藥率和包封率分別為6.0%和93.0%。與姜黃素相反，由于聚合粒子的包封率很高，姜黃素 NPs產生了高溶解度。根據Cur-PMMA NPs的SEM圖像和PMMA NPs，Cur-PMMA NPs和PAA-Cur-PMMA NPs的TEM圖像，可以看出粒子呈球形并且具有與DLS數據相似的粒徑，在PAA涂層后可見模糊涂層(圖1)。

2.2NPs藥物釋放PMMA NPs在PBS、0.9%氯化鈉溶液和血清中的藥物釋放情況見圖2。在PBS(40%)和0.9%氯化鈉溶液(20%)條件下，姜黃素在5 h內爆發釋放，隨后釋放平緩，在185 h內釋放達83.0%。在血清中觀察到高持續和控制釋放，其中在150 h內釋放40%，240 h內釋放75.0%。

2.3細胞攝取 與游離尼羅紅染料組相比，尼羅紅標記的NP樣品內化迅速(圖3)。30 min內，Cur-PMMA NPs和PAA-Cur-PMMA NPs處理的細胞內可觀察到明亮的熒光，游離姜黃素與之相比，可見非常低的熒光，NPs對照細胞未顯示熒光。

2.4體外抗癌活性 對PAA-Cur-PMMA NPs、Cur-PMMA NPs、游離姜黃素和NPs的體外抗癌活性進行評估。結果顯示，在24 h，游離姜黃素的細胞活性半數抑制率濃度(IC50)>100 μg·mL-1，而Cur-PMMA NPs的IC50濃度<12.5 μg·mL-1。在一定時間內(72 h)，Cur-PMMA NPs細胞抑制具有劑量和時間依賴性，且顯著高于游離姜黃素。24 h內，PAA-Cur-PMMA NPs表現出最大限度的細胞抑制，且在超過24 h細胞完全抑制(圖4，5)。

圖1 NPs的表征

圖2 NPs在PBS、0.9%氯化鈉溶液和血清中姜黃素的釋放曲線

Fig.2ReleaseprofileofcurcumininPBS，0.9%chloridesodiumsolutionorserum

3 討論

姜黃素是一種對肺癌、膀胱癌等多種腫瘤細胞具有抗癌活性的植物化學成分，且無明顯毒副作用，已有報道姜黃素對非小細胞肺癌A549細胞的抗腫瘤活性[3，9]。姜黃素與化療藥物聯合應用是預防和治療腫

瘤研究的熱點之一，在臨床化療中具有抗癌，逆轉耐藥及減毒多重作用，有助于提高化療療效。但由于姜黃素穩定性和溶解性低，限制了其臨床應用[5]。納米藥物制劑技術解決姜黃素的穩定性和溶解性低的問題，對于姜黃素的應用意義明顯。為此，利用藥物輸送系統，提高姜黃素的穩定性和生物利用度，降低藥物的毒性，筆者使用PMMA納米粒子來包載姜黃素。為進一步增強和延長藥物作用，采用PAA對NPs的表面進行了功能化處理，以保證NPs在病灶的停留時間更長。通過DLS證實，成功制備了Cur-PMMA NPs，該粒子大小均勻，呈球形，無明顯的團聚現象，在PAA涂層后可見模糊涂層。本研究中，PMMA NPs表現出較高的載藥率和包封率，說明PMMA與姜黃素分子具有良好的親和力。

圖3 NPs細胞攝取熒光圖像

圖4 5組A549細胞對NPs的攝取效果

圖5 4組A549細胞在不同時間內的活性比較

由于制劑在體內施用后到達癌細胞所需的時間，藥物的持續釋放將比快速釋放的制劑更有利[10]。姜黃素是一種不穩定的化合物，在體內藥物生物利用度低下。體外藥物釋放實驗結果顯示Cur-PMMA納米粒在血清中的緩釋效果較好，使得血清中姜黃素的持續釋放可以使藥物在要求的位點持續可用。

此外，本研究通過熒光顯微鏡觀察包載尼羅紅熒光染料的NPs的細胞攝取情況，證實了Cur-PMMA NPs具有更高的細胞攝取行為，Cur-PMMA NPs的攝取可確保細胞內的釋放，具有良好的靶向作用，從而使腫瘤細胞快速有效地死亡。細胞活性檢測也顯示，Cur-PMMA NPs的抑制細胞活性比姜黃素更好。本研究顯示，納米技術適合有效的局部藥物控制釋放，是提高難溶性藥物療效的一種有效途徑，有助于其在癌癥治療中的應用。