筋骨痛消丸對膝骨關節炎大鼠模型血清MLT、MMP-3、MMP-13的影響

王若旭 劉 源 李 峰 郭珈宜 郭艷幸

（1 佛山健翔醫院，廣東 佛山 528000；2 湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；3 河南省洛陽正骨醫院，河南 洛陽 471000）

膝關節骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種退行性骨關節疾病，以膝關節腫痛、活動受限為主要臨床表現[1-2]，是中老年人致殘的主要病種[3]。筋骨痛消丸臨床用于治療膝骨關節炎療效顯著，未見不良反應報道。在目前實驗研究報道中，已證實筋骨痛消丸可以降低血清和滑膜組織中IL-1β、TNF-α的表達水平[4-6]。本實驗通過探究筋骨痛消丸對膝骨關節炎大鼠模型血清中MLT、MMP-3及MMP-13表達水平的影響，從分子生物學水平有效闡明筋骨痛消丸治療膝骨關節炎的機制，提供實驗數據及理論依據，進而指導臨床運用。

1 材料與方法

1.1 動物分組：取40只SPF級SD大鼠，體質量200～220 g，雌雄各半（合格證號：SCXK（豫）2017-0001），購自河南省實驗動物中心，將其隨機平均分配成4組：空白對照組、模型對照組、陽性對照組、實驗組，每組10只。各組大鼠分籠飼養于河南省正骨研究院實驗室，光線及通風良好，自由飲水攝食。

1.2 藥品：根據臨床等效劑量人與大鼠給藥劑量比值為1∶6.17作為大鼠給藥劑量[7]（其中正常人所需劑量按60 kg體質量計算）。

1.2.1 雙醋瑞因膠囊（昆明積大制藥股份有限公司，批號：國藥準字J20150097）：在河南省正骨研究院實驗室進行藥液制備，將膠囊包衣祛除后，保留粉狀藥物，稱重0.072 g，配以生理鹽水至140 mL，充分攪拌，制成藥液。

1.2.2 筋骨痛消丸（河南省洛正藥業有限責任公司，批號：國藥準字Z10970117）：在河南省正骨研究院實驗室進行中藥液制備，將藥丸碾成粉狀后，稱重25.914 g，配以生理鹽水至140 mL，充分攪拌，制成中藥液。

1.2.3 木瓜蛋白酶（Beijing Solarbio Science &Technology Co.,Ltd，批號：1224H021）：稱重1.68 g粉狀木瓜蛋白酶，配以生理鹽水至42 mL混合，攪拌均勻，得到濃度為4%的木瓜蛋白酶溶液。

1.2.4 水合氯醛（Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd，批號：C10323758）：將塊狀水合氯醛碾成粉狀后，稱重20.00 g，加生理鹽水至200 mL混合，攪拌均勻，得到濃度為10%的水合氯醛溶液。

1.3 主要儀器。ELISA試劑盒：艾萊薩生物科技(上海)有限公司，試劑盒號：E20190201A；電子天平：日本AND公司；移液器：德國艾本德股份公司；酶標儀：北京普朗新技術有限公司；培養箱：上海精宏實驗設備公司。

1.4 方法

1.4.1 大鼠膝骨關節炎模型的建立：適 應性喂養3 d后造模。除空白對照組外，其余各組大 鼠均采用Panicker[8]造模法：無菌條件下抽取0.2 mL 4%木瓜蛋白酶溶液，將大鼠固定后，屈曲右側膝關節約45°，局部采取碘伏消毒后，從髕骨下極髕韌帶外側向髁間窩方向進針，出現落空感時即進入關節腔，關節腔內注射0.2 mL木瓜蛋白酶溶液，注射完畢后屈伸活動該膝關節，使溶液在關節腔內充分擴散。每2天注射1次，連續注射兩周，即制得膝關節骨關節炎大鼠模型。

1.4.2 藥物干預：完成造模后，次日起進行藥物干預。陽性對照組大鼠每天予以0.1 mL/10 g雙醋瑞因藥液給藥；實驗組每天予以0.1 mL/10 g筋骨痛消丸藥液給藥，空白對照組及模型對照組每天予以0.1 mL/10 g生理鹽水給藥。各組每天給藥1次，連續2周。

1.4.3 標本采集：各組大鼠末次給藥后4 h，大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉，采用心尖取血法采集樣本：固定大鼠，除毛，局部碘伏消毒，手指觸及大鼠心尖搏動最明顯處進針，垂直刺入心臟，抽取血液。每只大鼠取約2 mL血液置于試管，離心收集血清約1 mL，置于-70 ℃保存待測。

1.4.4 檢測指標及方法

1.4.4.1 關節腫脹度：藥物干預前及干預后，剔除大鼠右膝關節被毛，確定右側髕骨位置后，以髕中為測量起止點，以黑色記號筆標注大鼠右膝關節周徑，然后測量標記處黑色長度，即腫脹度，測量3次后計算得出平均值并進行記錄。

1.4.4.2 血清中MLT、MMP-3、MMP-13含量檢測：采用ELISA 法檢測MLT、MMP-3及MMP-13的含量，具體步驟嚴格按照ELISA試劑盒使用說明書進行操作。

1.4.5 統計方法處理：采用 SPSS20.0統計軟件進行數據分析與處理。定量資料用“均數±標準差”表示，若滿足正態性及方差齊性，運用單因素方差分析；若不滿足，則可采用秩和檢驗。檢驗標準α=0.05，P＜0.05認為有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠膝關節腫脹度（周徑）：藥物干預后，與模型對照組相比，陽性對照組和實驗組大鼠右膝關節的腫脹度均顯著降低（P＜0.05），實驗組大鼠右膝關節的腫脹度較陽性對照組的明顯降低（P＜0.05），見表1。

2.2 大鼠血清中MLT、MMP-3、MMP-13的表達水平：藥物干預后，與空白對照組對比，其余各組大鼠血清中MLT、MMP-3、MMP-13的表達水平均增高（P＜0.05），與模型對照組和陽性對照相比，實驗組大鼠血清中MLT的表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型對照組相比，陽性對照組和實驗組大鼠血清中的MMP-3、MMP-13表達水平均降低（P＜0.05），與陽性對照組相比，實驗組大鼠血清中的MMP-3、MMP-13表達水平更低（P＜0.05），見表2。

表1 各組大鼠腫脹度（周徑）（±s）

表1 各組大鼠腫脹度（周徑）（±s）

注：與空白對照組相比，*P＜0.05；與模型對照組相比，★P＜0.05；與陽性對照組相比，＃P＜0.05；n=10

表2 各組大鼠血清中MLT、MMP-3、MMP-13表達水平（±s）

表2 各組大鼠血清中MLT、MMP-3、MMP-13表達水平（±s）

注：與空白對照組相比，*P＜0.05；與模型對照組相比，★P＜0.05；與陽性對照組相比，＃P＜0.05；n=10

3 討論

據報道[9-10]，部 分中藥復方可通過調節臟腑功能進而調節機體褪黑素（MLT）水平，以防治疾病。筋骨痛消丸是國家級非物質文化遺產“平樂郭氏正骨”的傳統方，由洛陽平樂郭氏正骨第六代傳人郭維淮名老中醫采用丹參、雞血藤、香附(醋制)、烏藥、川牛膝、桂枝、威靈仙、秦艽、白芍、地黃、甘草等11味中藥組方而成，具有溫經通絡、行氣活血、消腫止痛之功效，臨床用于治療KOA療效顯著，未見不良反應報道。

KOA與MLT、MMP-3、MMP-13的表達水平關系密切。研究表明，基質金屬蛋白酶（MMPs）在軟骨組織中過量表達，會降解關節軟骨基質，是引發OA的主要原因[11-13]。MMP-3和MMP-13被廣泛認為與OA關節軟骨病理性降解密切相關[14-16]。MLT是一種具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等多種生物活性的神經內分泌激素，主要由松果體分泌[17-18]。Lim等[19]認為MLT通過參與炎癥和氧化應激的SIRT 1通路，對人軟骨細胞具有保護作用。研究表 明，MLT能降低TNF-α、IL-1β、PGE2和NO等炎性介質在軟骨細胞中的表達水平，抑制炎癥引起的MMP-3和MMP-13產生，對KOA產生積極作用[20]。

本實驗KOA模型大鼠血清中MMP-3、MMP-13的表達水平增高，關節軟骨降解破壞。實驗組大鼠血清中MLT表達水平顯著升高，MMP-3、MMP-13的表達 水平降低明顯。表明，筋骨痛消丸可以提升KOA大鼠模型血清中MLT 的表達水平，降低MMP-3、MMP-13的表達水平，說明筋骨痛消丸可以增強抗氧化、抗凋亡及抗炎等作用，抑制關節軟骨的降解破壞，對KOA的治療產生積極作用。