新型含硒類組蛋白去乙酰化酶抑制劑用于肝癌的治療

廖友生　康小英

【摘 要】本文通過體外細胞和皮下接種建立裸鼠皮下移植瘤模型來探討新型含硒類組蛋白去乙酰化酶抑制劑SelSA對肝癌的治療效果。實驗結(jié)果表明，SelSA對HepG2、Huh7、Hep3B和SMMC-7721四種肝癌細胞均展現(xiàn)出了良好的抑制活性，尤其是對Huh7有更強的選擇性;在動物體內(nèi)SelSA也展現(xiàn)出了顯著地抑制腫瘤生長效果。這些結(jié)果表明，SelSA是一類新型、有效的抗肝癌藥物，值得進一步研究。

【關(guān)鍵詞】組蛋白去乙酰化酶抑制劑;含硒化合物;抗腫瘤活性

【中圖分類號】R539【文獻標識碼】A【文章編號】1005-0019（2020）09--02

原發(fā)性肝癌是臨床上消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，具有高發(fā)病率、高死亡率，而我國的肝癌發(fā)病率位居世界第一[1]。手術(shù)治療和肝移植被公認為是當前肝癌治療的首選方法[2]，然而由于早期肝癌無特意的癥狀，當就診時患者通常已經(jīng)時中晚期，受腫瘤大小或轉(zhuǎn)移擴散情況的影響，只有約15%的患者能接受手術(shù)治療[3]。因此，藥物治療仍然是肝癌的一個重要治療方法。自2007年多靶點藥物索拉非尼被報道能顯著延長晚期肝癌患者生存期的效果以來[4]，開發(fā)靶向藥物已成為肝癌治療藥物研究的熱點[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙酰化酶在多種腫瘤中過表達[6]，采用組蛋白去乙酰化酶抑制劑對多種腫瘤具有治療作用，例如美國藥物食品管理局 （FDA）批準的伏立諾他 （SAHA）對多種肝癌細胞具有明顯地抑制活性[7]。最近，我們發(fā)現(xiàn)SAHA的衍生物SelSA不僅具體更強的組蛋白去乙酰化酶抑制活性[8]，而且SelSA是一種含硒的化合物，硒在人體中具有多種活性，也具有抗腫瘤活性。因此，在本研究中我們探討了SelSA的抗肝癌活性。通過細胞和動物實驗表明SelSA也對多種肝癌細胞有抑制活性，而在Huh7腫瘤模型中展現(xiàn)出了比SAHA更強的抗肝癌活性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與細胞株

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Hyclone公司;Matrigel購自美國BD公司;Balb/c裸鼠，4-5周齡，體重 18-23g，購置北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（SCXK（京） 2016-0011）。

1.2 動物模型構(gòu)建

取對數(shù)生長期的SMMC-7721細胞用胰酶消化后，離心、收集細胞，用Matrigel膠將細胞混懸。在裸鼠右側(cè)肩部皮下種植0.2ml細胞混懸液 （4×106～5×106細胞）。

1.3 體外抗腫瘤活性實驗

采用MTT法對SelSA進行體外抗腫瘤活性評價。將SelSA用DMSO溶解后，再用DMEM培養(yǎng)基稀釋成不同濃度。取對數(shù)生長期的測試細胞鋪至96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL （4～8）×104個/mL的細胞混懸液。置于37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育12小時，待細胞完全貼壁，棄去原培養(yǎng)液，加入100 ?L含有不同濃度的SelSA，繼續(xù)孵育3天，每孔加入30 μL 5 mg/mL 的MTT，孵育4小時后，每孔加入100 μL 二甲亞砜溶解。用酶標儀在490 nm波長處測定每孔的吸光度（OD）值，并計算出藥物對腫瘤細胞的抑制率。

1.4 體內(nèi)抗腫瘤活性實驗

待裸鼠的荷瘤體積約為100mm3大小時，隨機將裸鼠分成對照組和實驗組，每組 4只，均進行灌胃給藥，實驗組給予25mg/kg的劑量，對照組給予等體積的生理鹽水對照，每2天給藥一次，每隔2天用游標卡尺測試腫瘤的長寬，稱量小鼠的體重。在給藥18天后將小鼠的腫瘤取下，稱量腫瘤的重量。用OriginPro軟件繪制各組腫瘤的生長曲線。其中腫瘤的體積 （mm3） = （a × b2）/2，a，b 分別為腫瘤的長和寬;腫瘤抑制率 （%） = （1-T/C）×100，T和C分別表示治療結(jié)束后實驗組和對照組腫瘤的重量。

2 結(jié)果

2.1 體外抗腫瘤活性

體外抗腫瘤的結(jié)果如表1所示，兩個HDAC抑制劑SAHA和SelSA對HepG2、Huh7、Hep3B和SMMC-7721這四種肝癌細胞均有明顯地抑制活性，其IC50值均小于10 μM。與SAHA相比，SelSA對Huh7、Hep3B和SMMC-7721的抑制活性要強于SAHA，而對HepG2的抑制活性與SAHA相當。這些結(jié)果說明將SelSA抗肝癌活性優(yōu)于SAHA。

2.2 體內(nèi)抗腫瘤活性

在體外研究中，SelSA對肝癌SMMC-7721細胞展現(xiàn)出優(yōu)秀的抗腫瘤活性。因此，我們構(gòu)建了SMMC-7721動物模型來研究SelSA的體內(nèi)抗腫瘤活性，結(jié)果如圖1所示。與對照組相比，SelSA和SAHA治療后裸鼠的腫瘤生長明顯減慢。與體外抗腫瘤活性一致，SelSA抑制腫瘤生長的效果也要優(yōu)于SAHA。其中SelSA和SAHA抑制率分別為48%和37%。這些結(jié)果說明SelSA抗腫瘤效果優(yōu)于SAHA。此外，在應(yīng)用SelSA和SAHA治療期間，均沒有明顯地改變裸鼠的體重，這說明SelSA和SAHA的毒性較低。

3 討論

表觀遺傳學(xué)的調(diào)控失衡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。其中組蛋白的乙酰化和去乙酰化是表觀遺傳學(xué)的重要調(diào)控方式，并分別由組蛋白乙酰化酶和去乙酰化酶共同調(diào)節(jié)[9]。在腫瘤細胞，組蛋白去乙酰化酶呈現(xiàn)出過表達狀態(tài)，使得細胞調(diào)控失衡、惡變，并形成腫瘤細胞[10]。相應(yīng)地，抑制組蛋白去乙酰化酶的表達能夠抑制腫瘤細胞的分化，并促進腫瘤細胞凋亡。因此，組蛋白去乙酰化酶已成為近年來發(fā)展抗腫瘤藥物的重要靶標，目前已有多種組蛋白去乙酰化酶抑制劑上市用來治療腫瘤[11]。

盡管當前已成百上千的組蛋白去乙酰化酶抑制劑被報道了，但是從結(jié)構(gòu)上分析，這些抑制劑大致可以分為異羥肟酸類、苯甲酰胺類、環(huán)肽類、短鏈脂肪酸類和親電酮類等[12]。其中異羥肟酸類抑制劑具有較強的酶親和力和抗腫瘤活性，但是其異羥肟酸在體內(nèi)容易代謝成有毒的氫胺產(chǎn)物[13]。因此，尋找出新型、高效的組蛋白去乙酰化酶抑制劑對腫瘤治療具有重要的意義。最近，有文獻報道硒氰酸 （SeCN）也是組蛋白去乙酰化酶抑制劑的藥效團，其對應(yīng)的抑制劑SelSA不僅對組蛋白去乙酰化酶的抑制劑活性是異羥肟酸類SAHA的20倍[7]。這些結(jié)果說明SelSA是一類新型、高效的組蛋白去乙酰化酶抑制劑。鑒于SAHA本身存在缺陷，因此在本研究中我們探討了新型組蛋白去乙酰化酶抑制劑SelSA的抗肝癌活性。我們的結(jié)果表明，SelSA能夠?qū)Χ喾N類型的肝癌細胞均有強的抑制活性，在動物體內(nèi)也能展現(xiàn)出優(yōu)秀的抗肝癌活性，其效果甚至優(yōu)于SAHA。因此，SelSA可以作為先導(dǎo)化合物進一步被研究。

參考文獻

陳萬青， 崔富強， 樊春筍， 等.中國肝癌一級預(yù)防專家共識（2018）[J].中國腫瘤， 2018， 27（9）： 660-669.

Pinna AD， Yang T， Mazzaferro V， et al （2018） Liver transplantation and hepatic resection can achieve cure for hepatocellular carcinoma[J].Ann Surg， 2018， 268（5）： 868-875.

陳世發(fā)， 趙禮金.肝癌發(fā)生發(fā)展機制的研究進展及其治療現(xiàn)狀[J].中國普通外科雜志， 2018， 22（7）： 910-923.

Wilhelm SM， Adnane L， Newell P， et al.Preclinical overview of sorafenib， a multikinase inhibitor that targets both Raf and VEGF and PDGF receptor tyrosine kinase signaling[J].Mol Cancer Ther， 2008， （10）： 3129-3140.

Popow J， Arnhof H1， Bader G， et al.Highly selective PTK2 proteolysis targeting chimeras to probe focal adhesion kinase scaffolding functions[J].J Med Chem， 2019， 62（5）： 2508-2520.

Tang C， Du Y， Liang Q， et al.Development of a novel ferrocenyl histone deacetylase inhibitor for triple-negative breast cancer therapy[J].Organometallics， 2018， 37： 2368-2375

Luan Y， Li J， Bernatchez JA， Li R.Kinase and histone deacetylase hybrid inhibitors for cancer therapy[J].J Med Chem， 2019， 62（7）： 3171-3183.

Desai D， Salli U， Vrana KE， et al.SelSA， selenium analogs of SAHA as potent histone deacetylase inhibitors.Bioorg Med Chem Lett.2010， 20（6）： 2044-2047.

Makkar R， Behl T， Arora S.Role of HDAC inhibitors in diabetes mellitus[J].Curr Res Transl Med， 2019， S2452-3186（19）： 30030-30033.

Guerriero JL， Sotayo A， Ponichtera HE， et al.Class IIa HDAC inhibition reduces breast tumours and metastases through anti-tumour macrophages[J].Nature， 2017， 543（7645）： 428-432

Zhang B， Liu J， Gao D， et al.A fluorine scan on the Zn2+-binding thiolate side chain of HDAC inhibitor largazole： Synthesis， biological evaluation， and molecular modeling.Eur J Med Chem， 2019， 182： 111672.

Bertrand P.Inside HDAC with HDAC inhibitors[J].Eur J Med Chem， 2010， 45： 2095-2116.

Sanderson L， Taylor GW， Aboagye EO， et al.Plasma pharmacokinetics and metabolism of the histone deacetylase inhibitor trichostatin a after intraperitoneal administration to mice[J].Drug Metab Dispos， 2004， 32 （10）： 1132-1138.