星形膠質細胞在帕金森大鼠中的作用機制研究

李承家， 秦麗紅， 李承澤， 龔張鋆， 陳 洋， 王 辰

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見于中老年的神經系統變性疾病，主要病理改變為黑質-紋狀體多巴胺能通路變性。黑質紋狀體多巴胺能神經元死亡，多巴胺分泌減少是帕金森病的一個重要病理特征。星形膠質細胞是膠質細胞的一種，是腦內最廣泛的一類細胞。它們伸展充填在神經細胞的胞體及其突起之間，起支持、保護和分隔神經細胞的作用。星形膠質細胞在大腦中還有許多更加重要復雜的功能。而目前研究表明[1,2],星形膠質細胞在PD病變過程中發揮著重要作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選取由佳木斯大學動物中心提供健康雄性SD大鼠130只，月齡2.5～3 m，體重210～240 g，健康情況良好，用于PD大鼠模型100只，其中50只移入2型星形膠質細胞(type 2 Astroyts T2As)為PD+T2As組，余50只PD大鼠注射等量的生理鹽水于紋狀體為PD組；正常大鼠30只，注射等量的生理鹽水于正常SD大鼠紋狀體中，為對照組。

1.2 帕金森病大鼠模型的制備 給予SD大鼠腹腔注射4%的水合氯醛，麻醉后,固定于立體定向儀。使十字點前囟和人字點后囟相平，當門齒桿位置低于水平0度時，則顱骨水平位達成。在顱骨表面注藥點處鉆1個約2 mm的小孔。分別在以下兩點處各注入10 μg/5 μl含0.2%抗壞血酸的6-OHDA鹽溶液。第一點:前囟前1 mm，中線右側3.0 mm，硬膜下5 mm；第二點：前囟后0.2 mm，中線右側+2.6 mm，硬膜下6.0 mm。速度為1 μg/min，注射后留置4 min退出，縫合皮膚，碘酒擦拭縫合處。每天腹腔給予20萬U青霉素，共7 d以預防感染。模型建立2 w后，用阿樸嗎啡(apomnphine，APO)誘發旋轉，選210轉/30 min以上的動物為成功PD模型。對照組以生理鹽水代替6-OHDA鹽溶液,其余步驟與模型制作組相同。

1.3 T2As的分離純化及移植 取大腦皮質分散，用0.125%的胰酶消化7 min(37 ℃)，加含15%胎牛血清的完全培養基終止胰酶的消化作用，吸管反復吹打至細胞分散，得到單細胞懸液。以 3×105/cm2的細胞密度接種于培養瓶中，于培養箱中孵育30 min，以去除成纖維細胞。吸出細胞懸液，再接種于5%CO2培養箱中培養。收集未貼壁的O-2A祖細胞用篩網過濾，濾液經1000 rpm離心5 min，倒掉上清液，細胞因子培養液重懸后接種于PLL包被的六孔培養板中。將分離純化的O-2A祖細胞放于含20%FCS 的培養液中培養3 d，即可分化為T2As。將分離純化的T2As移植入PD大鼠的患側紋狀體，步驟與模型制作組相同。

1.4 單胺類遞質含量的測定 行為學實驗結束后，每周分別隨機選擇10只大鼠，行單胺類遞質含量的測定取大鼠紋狀體，液氮冷凍后存于-80 ℃冰箱。樣品處理：紋狀體組織準確稱重，按照1∶10的比例加人0.4 mol/L高氯酸，除去蛋白，高速冷凍離心機12000 r/min 4 ℃ 離心15 min。取上清，再置于12000 r/min 4 ℃ 離心20 min。取上清液加樣行，應用高效液相色譜-電化學法測定各組大鼠紋狀體內多巴胺含量，檢測各樣品的多巴胺(DA)，DA的代謝產物3,4二羥基苯乙酸(DOPAC)和高香芳酸(HVA)的含量。用外標法定量，以峰面積表示其含量。

2 結 果

2.1 大鼠旋轉行為的旋轉速度、維持時間測定 注射APO后誘導的旋轉行為表現為：頭部和軀干彎向健側(左側)旋轉，伴有震顫、咬尾足、尾部僵直等異常行為。健康對照組無旋轉行為。PD組出現明顯的旋轉行為，各周均數采用Bonfferonit檢驗，發現術后4 w達到較高水平，與第2周、第3周相比升高明顯(P<0.01)，PD+T2As組在第4～6周，與PD組比較旋轉速度明顯降低(P<0.01)(見表1)，大鼠維持旋轉行為的時間叫維持時間。PD組旋轉時間逐漸升高，到第4周后趨于穩定，PD+T2As組在第4～6周，與PD組比較旋轉速度明顯降低(P<0.01)(見表2)。

2.2 大鼠單胺類神經遞質(DA、DOPAC、HVA)的含量變化 健康對照組單胺類神經遞質(DA、DOPAC、HVA)各周比較均無明顯差別(P>0.05)，PD組與對照組比較單胺類神經遞質(DA、DOPAC、HVA)明顯低于對照組(P<0.01)，移植T2As后，DA、DOPAC、HVA含量逐漸升高，在第4周開始與第2周相比具有明顯區別(P<0.01)。在第3周開始均明顯高于PD組(P<0.01)(見表3～表5)。

表1 大鼠每周的旋轉速度轉/分)

與PD組比較*P>0.05;與PD組比較#P<0.01

表2 大鼠旋轉行為的維持時間

與PD組比較*P>0.05;與PD組比較#P<0.01

表3 大鼠紋狀體部位的DA含量變化

與對照組比較◇P<0.01;與PD組比較*P>0.05;與PD組比較#P<0.01;與同組第2周、第3周比較均△P<0.01

表4 大鼠紋狀體部位的DOPAC含量變化

與對照組比較◇P<0.01;與PD組比較*P>0.05;與PD組比較#P<0.01;與同組第2周、第3周比較△P<0.01

表5 大鼠紋狀體部位的HVA含量的變化

與對照組比較◇P<0.01;與PD組比較*P>0.05;與PD組比較#P<0.01;與同組第2周比較△P<0.01

3 討 論

在中樞神經系統神經元的發育過程中,星形膠質細胞(astrocyte,As)始終伴隨著其發育過程,不僅能起到支持和隔離的作用,還能起到調節細胞內外離子濃度、攝取、供給及滅活神經遞質、傳遞第二信使等功能。近年來,有報道[3,4]星形膠質細胞能分泌神經營養因子及釋放可溶性分子，進而保護神經元，對神經損傷具有清除作用。本實驗通過建立PD大鼠模型后將2型星形膠質細胞移植到PD大鼠紋狀體內，觀測3組大鼠(PD+T2As組、PD組、對照組)行為學改變(啟動時間、旋轉速度和維持時間)，同時觀察單胺類神經遞質(DA、DOPAC、HVA)在紋狀體中的變化，以期探究2型星形膠質細胞在PD大鼠中的作用。

應用6-OHDA建立大鼠PD模型的方法，有黑質內注射法、內側前腦束注射法和紋狀體內注射法。紋狀體較黑質體積大，注藥準確性高，模型更穩定，故本實驗采取兩點紋狀體內注射法，同時損毀尾殼核和蒼白球外側段，損傷更完全，6-OHDA注入紋狀體后，可被多巴胺能神經末梢攝取，逆行性損毀黑質內多巴胺能神經元。此過程是漸進性的，可以模擬PD的發病過程。根據實驗結果可見3組大鼠的旋轉速度、維持時間具有明顯區別，對照組明顯優于PD組和PD+T2As組，PD+T2As組從第4周開始較PD組有顯著改善；單胺類神經遞質(DA、DOPAC、HVA)在紋狀體中的含量在3組中的測定，結果提示從第3周開始PD+T2As組顯著高于PD組，PD組和PD+T2As組單胺類神經遞質含量在第2～6周均低于正常對照組。說明T2As對損傷的黑質-紋狀體通路具有修復和一定的保護作用，對PD損傷側的多巴胺能神經細胞具有延緩死亡、增加黑質-紋狀體DA的合成及釋放，減慢DA分解速度，可能在一定程度保護了損壞的DA能神經細胞。

神經組織由神經元和神經膠質細胞組成。在神經膠質細胞中，星形細胞數量最多,分布最廣。星形細胞廣泛分布于中樞神經系統的灰質和白質，具有神經膠質細胞的大部分功能，如：支持、修復與再生、吞噬與保護、運輸營養、參與構成血腦屏障、攝取化學遞質和分泌功能等。星形膠質細胞支持、引導神經元，并增強神經元的存活，促進神經元之間形成突觸連接。星形細胞又可分為T1As和T2As兩種。在LPS(一種位于革蘭氏陰性細菌細胞壁最外層的類脂多糖類物質，可刺激炎癥反應發生)的刺激下，他們觀察到靜息星形膠質細胞轉變為T1As，后者可以產生大量的炎癥因子。另一方面，T2As可由缺氧所誘導，在卒中腦組織附近分泌支持神經元生長，保證神經元健康及存活的物質。星形膠質細胞具有合成和分泌多種細胞因子的功能,包括可擴散的神經營養因子和非擴散的神經元支持物質,具有長期營養神經元、短暫刺激軸突生長等作用。分泌的腦源性生長因子、纖維粘連蛋白、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,BFGF)、層粘連蛋白、一氧化氮(NO)、膠質細胞源性生長因子等，雖然具體保護的分子機制不清楚，但這些營養因子能夠使DA能神經元減少神經毒性物質的損傷，對DA能神經元的營養、再生和分化的重要作用已在大量實驗中得到證實。

近年來，許多研究自由基生成和氧化應激促進了PD的發展，DA自身氧化可產生毒性代謝產物H2O2，與鐵作用后產生具有高毒性自由基，研究顯示PD患者黑質部分的過氧化物含量較多，受此氧自由基的影響變性的核酸及蛋白變性的數量明顯高于健康組，推測DA能神經元暴露于大量活性氧致使DA能神經元選擇性丟失，而星形膠質細胞可以產生谷胱甘肽過氧化物酶，它的作用可以阻止過氧化氫轉化為高毒性的羥自由基來達到抗氧化應激而發揮重要神經保護作用，這種保護作用對易受氧化應激的黑質DA能神經元來說尤為重要。研究顯示[5,6]晚期PD大鼠黑質部分含谷胱甘肽過氧化物酶陽性的星形膠質細胞密度顯著低于健康對照組，體外培養神經元細胞的過程中也發現星形膠質細胞可以保護神經元免受過氧化物誘導損傷。其作用機制可能是通過ATP依賴轉運體，NMDA受體所介導。所以推測星形膠質細胞的抗氧化應激機制參與PD神經保護作用。此外，在DA能神經元附近，DA自身氧化代謝產生的毒性氧自由基會對DA能神經元造成損傷，星型膠質細胞其表達的單胺氧化酶B(MAO-B)和兒茶酚胺氧位甲基轉移酶(COMT)對DA的作用代謝而保護仍舊存活的神經元，星型膠質細胞還可以大量攝取細胞外的興奮氨基酸減少其對黑質的毒性作用以起到保護神經元的目的[7]。但是，星形膠質細胞在某些刺激因素的作用下也可能通過釋放一些促炎癥因子[8,9]，如一氧化氮、腫瘤壞死因子-α等炎性因子對多巴胺能神經元造成損傷而推動帕金森病的發生和發展。

綜上所述，本實驗研究發現移植星形膠質細胞后的PD大鼠一段時間后行為學明顯改善，腦內單胺類神經遞質含量上調明顯，提示星形膠質細胞在PD的早期階段，在一定程度保護了黑質-紋狀體中受損的DA能神經細胞，保護作用是占主導作用。但星形膠質細胞在顱內后期分泌的神經遞質，以及是否可以定向分化為具有其他生理學的神經元，這些對DA能神經元的具體作用仍不清楚，所以，我們進一步研究PD的不同時期星形膠質細胞的確切作用機制，對于治療帕金森病有著重要的意義。