右美托咪定調節MAPK/ERK-CREB通路對大鼠海馬神經元凋亡的保護作用

朱建坡， 梁 冰

神經系統疾病常發生于中樞神經、周圍神經、植物神經系統，主要以運動、感覺和植物神經功能障礙為主要癥狀的疾病[1,2]。研究表明，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號通路與神經系統性疾病密切相關，抑制MAPK信號通路可以減少海馬神經元損傷和凋亡[3,4]。右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)是一種α-2腎上腺素能受體激動劑，研究表明，DEX可減輕大鼠慢性神經病理性疼痛，抑制MAPK、磷酸化細胞外調節蛋白激酶(phosphoryltion of extracellular regulatory protein kinases，pERK)、磷酸化環磷腺苷效應元件結合蛋白(phosphoryltion of cAMP response element binding protein，pCREB)表達，推斷DEX通過調控MAPK/ERK-CREB通路對海馬神經元凋亡起保護作用[5]。本實驗通過對大鼠構建癲癇持續狀態(status epilepticus，SE)模型機構建立一種神經系統疾患，觀察DEX對SE大鼠行為及MAPK/ERK-CREB通路的影響，以初步探究DEX對SE大鼠海馬神經元凋亡保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康Sprague-Dawley SPF級雄性大鼠40只，6～8周齡，體重200 g左右，由中國醫科大學附屬盛京醫院實驗動物中心提供，動物許可證號:2016PS260K。飼養條件：溫度(22±2)℃，濕度40%～70%，每籠5只，自由攝食飲水，常規飼養1 w進行實驗。本研究對于大鼠處理均符合實驗動物福利與倫理委員會原則。

1.2 試劑及儀器 DEX(國藥準字H20090248)購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；Nissl染色試劑盒(貨號：WLA128)購自萬類生物有限公司，TUNEL試劑盒(貨號：C1086)購自碧云天生物技術研究所；GAPDH抗體(貨號：ab181602)、p-ERK抗體(貨號：ab79483)、p-CREB抗體(貨號：ab220798)、caspase-3抗體(貨號：ab13847)、Bax抗體(貨號：ab32509)、Bcl-2抗體(貨號：ab182858)均購自美國Abcam公司；毛果蕓香堿(貨號：MB5259)購自美侖生物有限公司；氯化鋰(貨號：L1110)、阿托品(貨號：AT100)購自美國Spectrum公司；地西泮(貨號：BZ2886)購自上海恪敏生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標記的二抗(貨號：BHR101)購自北京博爾西科技有限公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒(貨號：P0010S)購自上海碧云天公司；蛋白電泳及電轉移裝置(型號：AU5800)購自北京市六一儀器廠；酶聯免疫分析儀(型號：EVO75)購自澳大利亞Techan公司；超低溫冰箱(型號：MDF-U32V)購自美國Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠SE模型構建[6]及分組 大鼠SE模型構建：大鼠腹腔注射3 mmol/kg 氯化鋰，24 h后同一部位注射50 mg/kg毛果蕓香堿，觀察大鼠行為，根據癲癇發作Racine分級進行判斷，大于4級，表明癲癇模型點燃成功。發作持續15 min后腹腔注射1 mg/kg阿托品，40 min后給予10 mg/kg地西泮腹腔注射直至發作終止從而進行控制。將大鼠隨機分為正常對照組、陽性對照組、SE組、SE+DEX組，每組各10只。SE模型構建成功后，SE+DEX組大鼠腹腔注射1 μmol/L DEX；SE組、正常對照組腹腔注射同量0.9%氯化鈉液；陽性對照組大鼠腹腔注射1 μmol/L苯巴比妥，藥物干預24 h后留取標本。根據改良后Racine分級[7]：正常狀態，0級；出現雙目緊閉，面部細纖維肌束發生顫動(如耳朵和胡須等部位)，伴隨吸氣動作,1級；出現點頭頻率，面部肌束顫動明顯,2級；前肢單肢發生抽搐,3級;前肢均發生陣攣，身體無直立,3.5級；前肢均發生陣攣，身體直立，4級；身體強直，伴隨肢體倒向一側，4.5級；出現強直陣攣，身體直立且背部倒地，5級。

1.3.2 動物行為學觀察 給藥后，對所有大鼠按Racine評分標準分別進行評分，每20 min作為一個評分時間點，連續觀測，監測120 min，記錄并計算各組大鼠Racine評分。

1.3.3 樣品采集 給藥24 h后，每組隨機抽取5只腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉后，采用20 ml生理鹽水和4%多聚甲醛40 ml經心臟灌注，取腦后采用4%多聚甲醛浸泡過夜，大腦標本在4%多聚甲醛固定24 h進行常規脫水、透明、石蠟包埋，制備海馬組織蠟塊置于4 ℃冰箱保存。用石蠟切片機作冠狀切面連續切片，切片厚度約為4 μm，主要用于Nissl法和TUNEL法檢測。另將每組剩余5只大鼠常規麻醉后，迅速斷頭取腦組織，在4 ℃條件下鈍性分離大鼠雙側海馬組織，迅速置于液氮罐中保存，用于Western blot檢測。

1.3.4 Nissl法檢測細胞損傷 將1.3.3中制備石蠟切片于二甲苯、不同濃度乙醇中浸泡，1%甲苯胺藍染色40 min，后分色，脫水至透明后，封片，最后于顯微鏡下觀察并對尼氏陽性的細胞進行計數。

1.3.5 TUNEL法檢測細胞凋亡 將1.3.3中制備的石蠟切片于二甲苯、不同濃度乙醇中浸泡5 min后，用蛋白酶K室溫消化1 h后，按TUNEL試劑盒說明書將切片進行染色、終止反應、封片等，于熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡數目。經TUNEL染色的陽性細胞呈棕黃色或棕褐色。

1.3.6 Western blot法檢測大鼠海馬組織中MAPK/ERK-CREB通路相關蛋白、凋亡相關蛋白表達 從液氮罐中取出海馬組織，然后按照1∶5(wt/vol)加入500 μl細胞裂解液用玻璃研磨器研磨海馬組織，裂解30 min后提取組織蛋白，離心取上清液即總蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度后，進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后加入一抗(MAPK、pERK、pCREB、caspase-3、Bax、Bcl-2、GAPDH抗體，1∶1500)，4 ℃孵育過夜，次日洗膜后加二抗(1∶5000)室溫孵育2 h，TBST洗膜，加ECL發光液，在凝膠成像系統中拍照。

2 結 果

2.1 各組大鼠的行為學觀察 與正常對照組相比，SE、陽性對照組、SE+DEX組大鼠Racine分值顯著增加(P<0.05)，與SE組相比，陽性對照組、SE+DEX組大鼠Racine分值顯著降低(P<0.05)(見表1)。

表1 各組大鼠Racine分值

與正常對照組比較*P<0.05；與SE組比較#P<0.05

2.2 各組大鼠海馬神經元損傷及凋亡情況

2.2.1 細胞損傷結果 正常對照組大鼠海馬區神經元邊緣清晰，排列整齊，胞漿中可見尼氏小體；SE組大鼠海馬區神經元缺失嚴重、排列松散，胞漿深淺不一，核仁消失或不明顯；陽性對照組、SE+DEX組，神經元缺失減少，排列較規律(見圖1)。對大鼠海馬神經元計數分析結果顯示，與正常對照組相比，SE組、陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬神經元數顯著減少(P<0.05)；與SE組相比，陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬神經元數顯著增加(P<0.05)(見表2)。

2.2.2 細胞凋亡結果 SE組、陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬區神經椎體細胞固縮。TUNEL陽性細胞計數分析結果顯示，與正常對照組相比，SE、陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬區棕褐色陽性細胞顯著增加(P<0.05);與SE組相比，陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬區棕褐色陽性細胞顯著減少(P<0.05)(見圖2、表3)。

2.3 各組大鼠海馬組織中MAPK/ERK-CREB通路相關蛋白表達結果比較 與正常對照組相比，SE、陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬組織中MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白表達量顯著升高(P<0.05)；與SE組相比，陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬組織中MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白表達量顯著降低(P<0.05)(見圖3、表4)。

2.4 各組大鼠海馬組織中凋亡相關蛋白表達結果比較 與正常對照組相比，SE、陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬組織中caspase-3、Bax、Bax/Bcl-2蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達量顯著降低(P<0.05)；與SE組相比，陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬組織中caspase-3、Bax、Bax/Bcl-2蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達量顯著升高(P<0.05)(見圖4、表5)。

組別例數海馬神經元數量(個)正常對照組SE組陽性對照組SE+DEX組5555145.32±5.1262.14±4.01*73.12±4.12*#76.45±3.98*#

與正常對照組比較*P<0.05；與SE組比較#P<0.05

組別例數海馬區凋亡細胞數量(個)正常對照組SE組陽性對照組SE+DEX組55551.32±0.0215.32±1.13*12.24±1.10*#11.86±1.08*#

與正常對照組比較*P<0.05；與SE組比較#P<0.05

表4 各組大鼠海馬組織中MAPK/ERK-CREB通路相關蛋白表達結果

與正常對照組比較*P<0.05；與SE組比較#P<0.05

表5 各組大鼠海馬組織中凋亡相關蛋白表達結果

與正常對照組比較*P<0.05；與SE組比較#P<0.05

a：正常對照組；b：SE組；c：陽性對照組；d：SE+DEX組

圖1 各組大鼠海馬神經元Nissl染色圖

a：正常對照組；b：SE組；c：陽性對照組；d：SE+DEX組

a：正常對照組；b：SE組；c：陽性對照組；d：SE+DEX組

圖3 各組大鼠海馬組織中p-ERK、p-CREB蛋白表達圖

a：正常對照組；b：SE組；c：陽性對照組；d：SE+DEX組

圖4 各組大鼠海馬組織中凋亡相關蛋白表達圖

3 討 論

神經性疾病發生會引起患者癱瘓、共濟失調、肌萎縮側索硬化、頭痛、反射異常、肌萎縮、排尿、排糞、性功能障礙等癥狀。SE屬于神經性疾病，是由多種病因共同引起的一種慢性腦部疾病[8]。隨著社會發展、飲食習慣變化，神經性疾病的發病率逐年升高，嚴重影響人們的身體健康和生活質量[9]。臨床上對于神經性疾病治療，多以藥物控制為主，但目前藥物對智力、運動功能、情緒等方面造成嚴重的副作用，因此找尋找新的藥物對神經性疾病的治療具有重要意義。DEX主要是作用于中樞神經及周圍神經系統，有鎮靜、鎮痛、抑制交感神經活動等作用，臨床多與鎮靜、鎮痛藥物聯合使用進行麻醉[10]，最近有研究表明DEX對SE有良好的治療作用[11]。本研究通過觀察各組大鼠的行為學發現，與正常對照組相比，SE、陽性對照組、SE+DEX組大鼠Racine分值顯著增加；與SE組相比，陽性對照組、SE+DEX組大鼠Racine分值顯著降低，提示SE大鼠模型構建成功，DEX對SE大鼠有一定治療作用。SE是一種以中樞神經功能障礙為特征的腦部疾病，由于海馬區的腦神經元過度興奮，持續頻繁的興奮會造成腦內神經遞質等化學物質發生病變所引起的。丁秀芳等[12]研究發現，SE可導致海馬區神經元損傷。本研究發現，與正常對照組相比，SE組、陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬區神經元缺失嚴重，核仁消失或不明顯，神經椎體細胞固縮，大鼠海馬神經元數顯著減少，海馬區棕褐色陽性細胞顯著增加，提示SE發生會引起海馬神經元數減少，海馬神經元凋亡增加。研究表明，DEX可以抑制海馬神經元損傷[13]。本研究發現，與SE組相比，陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬神經元數顯著增加，海馬區棕褐色陽性細胞顯著減少，提示DEX可以抑制海馬神經元數減少和海馬神經元凋亡。

caspase-3是一種剪切酶，在細胞凋亡中不可缺失，Bax屬于Bcl-2家族，是凋亡促進基因，Bcl-2是抗凋亡基因，Bax可以與Bcl-2形成二聚體結構[14]。早期研究發現，Bax/Bcl-2比例可以表明細胞凋亡的強弱，本研究發現，與正常對照組相比，SE、陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬組織中caspase-3、Bax、Bax/Bcl-2蛋白表達量顯著升高，Bcl-2蛋白表達量顯著降低，提示caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達與細胞凋亡密切相關。研究表明，降低海馬區Bax、caspase-3表達，提高Bcl-2表達，DEX可以抑制AD大鼠海馬區內細胞凋亡[15,16]。本研究發現，與SE組相比，陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬組織中caspase-3、Bax、Bax/Bcl-2蛋白表達量顯著降低，Bcl-2蛋白表達量顯著升高，提示DEX可能通過抑制caspase-3、Bax表達，促進Bcl-2蛋白表達，抑制細胞凋亡。

MAPK家族主要作用是將細胞外信號傳導到細胞內部與ERK1/2在腦部海馬區發揮重要作用[17]。ERK通路可以激活CREB使其發生磷酸化，調控神經元發育、興奮、凋亡等過程[18]。本研究發現，與正常對照組相比，SE、陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬組織中MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白表達量顯著升高，提示MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白表達與SE發生密切相關。研究表明，抑制MAPK信號通路對海馬神經元毒性損傷起到一定的保護作用[19]。本研究發現，與SE組相比，陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬組織中MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白表達量顯著降低，提示DEX可以抑制MAPK、p-ERK、p-CREB表達，推測DEX可能通過抑制MAPK/ERK-CREB通路抑制海馬神經元凋亡，對海馬神經元損傷發揮保護作用。

綜上所述，DEX可能通過抑制MAPK/ERK-CREB通路抑制海馬神經元凋亡，對其發揮保護作用。需進一步研究DEX調控MAPK/ERK-CREB通路治療神經性疾病有效性及其調控其他信號通路的可能作用機制。