血清mir-210、HIF-1α水平與動脈瘤性蛛網膜下腔出血后遲發性腦缺血的關系

王 娜， 卞玉杰， 田繼新

動脈瘤性蛛網膜下腔出血(aneurysmal subarachnoid hemorrhage，aSAH)是一種非常嚴重的腦血管疾病，其病情兇險，易并發遲發性腦缺血(delayed cerebral ischemia，DCI)，嚴重影響患者神經功能恢復。近年來，aSAH后DCI發病率越來越高，是導致aSAH患者殘疾、死亡的主要原因[1]。因此，早期預測aSAH后DCI發生顯得至關重要。

研究發現微小RNA(microRNA，miRNA)參與調節腦卒中的各個環節，在其發生、發展過程中具有重要作用[2]。微小RNA-210(microRNA-210，mir-210)是miRNA中重要一員，能夠促進血管新生，其水平變化與頸動脈狹窄程度相關[3]。而缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是機體缺氧時重要的核轉錄因子，其能通過調控mir-210表達促進疾病發展[4]。

為探討血清mir-210、HIF-1α水平在aSAH后DCI發生中的作用，本研究通過測定260例aSAH患者血清mir-210、HIF-1α水平，用于評估兩者與aSAH后DCI發生可能關系，并探討血清mir-210、HIF-1α水平對aSAH后DCI發生的預測價值。結果如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年10月-2019年10月在本院神經外科診治的260例aSAH患者作為研究對象，其中男性114例，女性146例；年齡30～70歲，平均年齡(55.27±12.81)歲。納入標準：(1)均符合aSAH相關診斷標準[5]；(2)臨床資料齊全；(3)均為初次發病；(4)發病至入院時間<24 h。排除標準：(1)非動脈瘤破裂所致蛛網膜下腔出血者；(2)入院7 d內死亡；(3)伴有嚴重肝、腎功能不全者；(4)伴有顱內感染或血液系統疾病者。本研究符合本院倫理委員會要求，且患者或家屬簽署《知情同意書》。

1.2 方 法

1.2.1 DCI診斷標準及分組 DCI診斷標準[6]：(1)發病4 d后出現肢體癱瘓、意識下降、失語等神經功能缺損體征；(2)經電子計算機斷層掃描(computed tomography，CT)排除顱內再出血、腦水腫、腦積水等因素；(3)經復查頭部CT可見新的梗死灶；(4)上述癥狀至少持續1 h。根據aSAH后DCI發生情況將260例患者分為未發生DCI組(n=181)、發生DCI組(n=79)。

1.2.2 臨床資料收集 護理人員收集兩組患者性別、年齡、發病至入院時間、高血壓、吸煙(吸煙≥1支/d，且至少持續1 y者，即為吸煙)、飲酒(乙醇攝入量≥50 g/d，且至少持續1 y者，即為飲酒)、動脈瘤大小、動脈瘤位置(前循環或后循環)、Hunt-Hess分級(分為1級、2級、3級、4級、5級)、Fisher分級(分為1級、2級、3級、4級)及治療方式(手術夾閉或血管內栓塞)等資料。

1.2.3 血清mir-210、HIF-1α水平測定 收集患者入院時肘靜脈血3 ml，3000 r/min離心10 min，抽取血清保存于-70 ℃低溫冰箱中。血清mir-210水平使用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)進行測定。按照TRIzol試劑盒(貨號：15596018，購自武漢純度生物科技有限公司)說明書從血清中提取總RNA，以紫外分光光度計檢測其濃度及純度，并依據PrimeScriptTMRT試劑盒(貨號：RR055A，購自北京冬歌博業生物科技有限公司)說明書合成cDNA鏈。以U6為對照進行擴增，引物均是根據GenBank數據庫提供的核酸序列進行設計，mir-210引物為：上游5’-GTGCAGGGTCCGAGGTCGGC-3’，下游5’-CTGTGCGTGTGACAGCGGCTGA-3’；U6引物為：上游5’-CTCGCTTCGGCACCACAAAT-3’，下游5’-AACGCTTCACGAATTTGCGTCAT-3’。反應條件為：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，72 ℃、20 s，共40個循環。每個樣本均重復3次，并用2-△△Ct法計算血清mir-210表達量。血清HIF-1α水平使用酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)進行測定，測定方法按試劑盒(貨號：X-EL-H1277c，購自上海江萊生物科技有限公司)說明書進行。

采用Pearson檢驗分析aSAH患者血清mir-210水平與HIF-1α水平的相關性；采用多因素Logistic回歸分析影響aSAH后DCI發生的危險因素；并使用ROC曲線分析血清mir-210、HIF-1α水平對aSAH后DCI發生的預測價值。均以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組患者臨床資料比較 兩組患者性別、年齡、發病至入院時間、高血壓、吸煙、飲酒、動脈瘤大小及治療方式相比，差異均無統計學意義(P>0.05)；兩組患者動脈瘤位置、Hunt-Hess分級及Fisher分級情況相比，差異均有統計學意義(P<0.05)(見表1)。

2.2 兩組患者血清mir-210、HIF-1α水平比較 發生DCI組患者血清mir-210、HIF-1α水平均明顯高于未發生DCI組患者(P<0.05)(見表2)。

2.3 aSAH患者血清mir-210水平與HIF-1α水平相關性 aSAH患者血清mir-210水平與HIF-1α水平呈正相關(r=0.693，P<0.05)(見圖1)。

2.4 影響aSAH后DCI發生的危險因素分析 以aSAH后是否發生DCI為因變量，以動脈瘤位置、Hunt-Hess分級≥3級、Fisher分級≥3級及血清mir-210、HIF-1α高水平為自變量進行Logistic回歸分析，變量賦值(見表3)。結果顯示Hunt-Hess分級≥3級、Fisher分級≥3級及血清mir-210、HIF-1α水平是影響aSAH后DCI發生的獨立危險因素(P<0.05)(見表4)。

2.5 血清mir-210、HIF-1α水平對aSAH后DCI發生的預測價值 血清mir-210水平聯合HIF-1α水平預測aSAH后DCI發生的曲線下面積高于血清mir-210水平(Z=2.018，P=0.044)、HIF-1α水平(Z=3.338，P=0.001)單獨預測，其預測敏感度為83.33%，特異度高達94.44%(見表5、圖2)。

表1 兩組患者臨床資料比較

與未發生DCI組患者相比*P<0.05

表2 兩組患者血清mir-210、HIF-1α水平比較

與未發生DCI組患者相比*P<0.05.

表3 變量賦值

表4 影響aSAH后DCI發生的危險因素分析

表5 血清mir-210、HIF-1α水平對aSAH后DCI發生的預測價值

圖1 aSAH患者血清mir-210水平與HIF-1α水平相關性

圖2 血清mir-210、HIF-1α水平預測aSAH后DCI發生的ROC曲線

3 討 論

DCI是aSAH最主要的并發癥，易導致患者局部腦組織缺血或壞死，發生不可逆缺血性神經功能損害，對患者身心健康造成嚴重影響。相關研究證實[7]，DCI具有較高的致殘率和病死率，且其發生與aSAH患者病情恢復有關。因此，尋找可靠有效的血清標記物早期預測aSAH后DCI發生情況具有一定臨床價值，以期為早期防治aSAH后DCI提供有力依據。

miRNA是一類單鏈非編碼小RNA，大多數miRNA可能通過調控血管內皮生長因子而參與大腦缺血、缺氧過程[8]。mir-210是在缺氧環境下表達水平較穩定的miRNA之一，位于人染色體11p15.5，其在促進腦缺血后血管新生過程中發揮重要作用[9]。Wang等[10]研究發現，急性腦梗死患者血清mir-210表達水平明顯高于正常對照組，且血清mir-210表達水平可作為診斷急性腦梗死的有效指標。本研究結果發現，發生DCI組患者血清mir-210水平遠高于未發生DCI組患者，與Wang等[10]研究結果類似，提示血清mir-210水平升高可能與aSAH后DCI發生有關。且相關研究報道[11]，miRNA可作為HIF-1α的調節因子，在轉錄后水平HIF-1α的表達中具有重要調節作用。而HIF-1α位于人14號染色體q21-24區，通常在低氧環境中存在，其下游靶基因血管內皮生長因子參與血管生成、細胞能量代謝等多個生理、病理過程[12]。研究發現HIF-1α異常表達參與缺血、缺氧性疾病的發展過程[13]。陳錦艷等[14]研究報道，腦出血組大鼠血清HIF-1α水平遠高于正常組大鼠。此外，郭異之等[15]研究發現，重型顱腦損傷預后不良患者血清HIF-1α水平明顯高于預后良好組患者，其水平變化可作為近期預后的早期預測指標。本研究中，與未發生DCI組患者相比，發生DCI組患者血清HIF-1α水平明顯升高，與郭異之等[15]研究相似，提示血清HIF-1α水平升高可能參與aSAH后DCI發生。

本研究結果還發現，aSAH患者動脈瘤位置、Hunt-Hess分級及Fisher分級情況均可能與DCI發生有關。Pearson檢驗分析顯示，aSAH患者血清mir-210水平與HIF-1α水平呈正相關，提示血清mir-210、HIF-1α水平可能共同參與aSAH發生、發展，并可能在DCI發生中發揮重要作用。多因素Logistic回歸分析顯示，Hunt-Hess分級≥3級、Fisher分級≥3級及血清mir-210、HIF-1α高水平均是影響aSAH后DCI發生的獨立危險因素，提示除Hunt-Hess分級≥3級、Fisher分級≥3級因素外，臨床測定血清mir-210、HIF-1α水平可能有利于預測aSAH后DCI發生情況，對早期防治aSAH后DCI具有積極作用。此外，本研究ROC曲線分析結果顯示，血清mir-210、HIF-1α水平預測aSAH后DCI發生的曲線下面積分別為0.879、0.822，提示兩者均可作為預測aSAH后DCI發生的指標，但預測敏感度均較低，且特異度也不高，臨床單獨預測具有一定局限性。因此，本研究進一步使用血清mir-210水平聯合HIF-1α水平預測aSAH后DCI發生情況，結果顯示曲線下面積為0.940，均高于兩者單獨預測，且特異度高達94.44%，提示血清mir-210、HIF-1α水平聯合預測aSAH后DCI發生的應用價值高于兩者單獨使用。

綜上所述，本研究血清mir-210、HIF-1α水平升高可能與aSAH后DCI發生有關，檢測血清mir-210、HIF-1α水平有望作為評估aSAH后DCI發生的重要指標，尤其是兩者聯合可能價值更高，臨床應密切關注aSAH患者血清mir-210、HIF-1α水平變化，以期為早期防治DCI提供幫助。臨床上影響aSAH后DCI發生的因素較多，可能會影響本研究結果準確性，應擴大樣本量繼續研究。