復(fù)方益肝顆粒中活性成分的提取工藝研究

陳東紅,黃阿賢

(1.福建省藥械聯(lián)合采購中心,福建 福州 350001；2.福建漳州美利得生物工程公司,福建 漳州 363600)

復(fù)方益肝顆粒系漳州美利得生物工程公司擬在原南靖縣中醫(yī)院用于治療慢性乙肝老驗方的基礎(chǔ)上研發(fā)的中藥新制劑。驗方是由原福建省名老中醫(yī)肖子精主任提供的，由苦參(君藥)、虎杖、茵陳、白笈、田雞黃等數(shù)味中草藥組成的復(fù)方制劑(原為水煎劑)。其作為醫(yī)院制劑用于治療慢性乙肝50余年，臨床上取得較好療效。本實驗是在原處方加以改良，并通過正交試驗確立提取工藝。

1 實驗材料

1.1 儀 器

薄層色譜儀(上海科哲生化科技公司);AB-8型大孔吸附樹脂(天津波鴻樹脂科技有限公司);高效硅膠G板100 mm×200 mm(青島基億達公司)。

1.2 試藥與試劑

復(fù)方益肝顆粒(漳州美利得生物工程公司,190926);苦參堿、氧化苦參堿對照品(中國藥品生物制品檢定所);苦參、虎杖、茵陳等藥材(漳州藥材站)。試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層掃描法測定苦參堿

2.1.1苦參藥材供試液的制備

稱取苦參藥材粗粉約1.0 g，置具塞錐形瓶中，加氯仿25 mL、濃氨試液0.5 mL，按文獻方法制備，定容到5 mL即得[1-3]。

2.1.2復(fù)方益肝膠囊供試品溶液的制備

稱取復(fù)方益肝顆粒內(nèi)容物1.0 g,置有塞錐形瓶中，加氯仿15 mL，濃氨試液0.5 mL，按文獻方法制備，定容到2 mL即得[1-3]。

2.1.3陰性對照液的制備

取除苦參以外的所有藥材，按照樣品供試液的制備方法制備陰性對照液。

2.1.4對照品溶液的制備

精密稱取苦參堿標準品2.2 mg，加無水乙醇定容于1 mL容量瓶中，制成1.1 g/L對照品溶液。

2.1.5對照品溶液的制備

薄層色譜條件及掃描條件高效硅膠G板100 mm×200 mm，點樣后氨熏15 min；異辛烷-丙酮-醋酸乙酯-氨水(4.5∶4.5∶6∶0.3)為展開劑，氨預(yù)飽和15 min，稀碘化鉍鉀試液顯色，λs=480 nm，λR=650 nm,雙波長反射式鋸齒掃描。

2.1.6線性關(guān)系考察

精密吸取對照品溶液1、2、3、4、5 μL，點于同一硅膠G薄層板上,依法展開,顯色,掃描測定。以點樣量為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線。回歸方程為γ=-23 899.6+72 406.3X(r=0.9989，n=5)。苦參堿在1.17～5.83 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.7對照品溶液的制備

測定方法精密吸取對照品溶液1 μL和2 μL,苦參藥材供試液2 μL，復(fù)方益肝顆粒供試液和陰性對照液各1.5 μL，按標準曲線項下點樣，展開，掃描，Rf=0.65，用外標一點法計算含量。

2.1.8回收率試驗

精密吸取已知含量的樣品3次，分別加入對照品適量，點樣展開，掃描測定。結(jié)果平均回收率98.81%，RSD1.95%，實驗表明回收率良好。

2.1.9精密度試驗

精密吸取對照品溶液1 μL，按標準曲線方法重復(fù)點樣5次，展開，掃描，峰面積的RSD=1.37%。

2.2 正交試驗

2.2.1因素水平表的研究

參照預(yù)實驗結(jié)果，在各提取條件中，水用量﹑提取時間、提取次數(shù)對提取的浸膏得率有一定影響。在水平分布的選擇時，中間水平實驗的浸膏得率(9倍量水提取2次，每次2 h)在每一組中均超過了85%，同時考察提取條件對苦參堿指標成分的影響概況，故按表1進行L9(34)正交試驗。

按處方比例取各藥材(水浸泡30 min),按正交試驗條件加水加熱提取數(shù)次,濾過,合并濾液,定容于50 mL容量瓶中備用。

表 1 正交試驗因素水平表

2.2.2苦參正交試驗樣品測定

量取正交提取液各5 mL于分液漏斗中，加入濃氨水2 mL，參照文獻方法制備供試品液[2-3]，定容為約1 mL。取供試品液2 μL照上述測定方法測定。正交試驗分析表見表2。方差分析表明，各因素對苦參堿提取含量無顯著性影響。

實驗中發(fā)現(xiàn)苦參藥材水提物中既含有苦參堿，也含有氧化苦參堿，但在本復(fù)方制劑中無法檢測到氧化苦參堿(圖1,色譜條件：高效硅膠G板10 cm×20 cm，點樣后氨熏15 min；展開劑為氯仿-甲醇-氨水=8∶1∶0.2，稀碘化鉍鉀試液顯色)；提示可能有氧化苦參堿逐漸向苦參堿轉(zhuǎn)化。

表 2 L9(34)苦參堿正交試驗分析表

3 討 論

本實驗選擇苦參堿為復(fù)方益肝顆粒劑中君藥苦參含量測定的指標成分之一，可作為輔助控制該劑型的質(zhì)量標準。薄層掃描檢測苦參堿時發(fā)現(xiàn)，在苦參堿對照品相應(yīng)位置，后者的斑點較大，說明后者提取效率更高，故采用第二種提取方法[2-3]。

1.苦參藥材,2.復(fù)方益肝顆粒,3.樣品,4.氧化苦參堿

由于苦參堿中含有多種生物堿,在薄層色譜中分離較為困難。本實驗采用氯仿-甲醇-氨水、環(huán)己烷-氯仿-甲醇-氨水、環(huán)己烷-氯仿-丙酮-甲醇-氨水、異辛烷-丙酮-醋酸乙酯-氨水等多種展開劑，結(jié)果表明,以異辛烷-丙酮-醋酸乙酯-氨水為展開劑,可使苦參堿與其他,堿類成分分離完好,斑點清晰。本法可為復(fù)方中藥制劑中苦參堿測定提供參考[4-6]。

正交試驗表明水用量、提取時間及次數(shù)3個因素對本處方中苦參堿含量均無顯著影響,因此其最佳工藝將根據(jù)配方中另一指標成分虎杖苷含量的測定結(jié)果再確定。