不同分子量透明質酸對肺癌小鼠體內腫瘤生長轉移的影響

郝利銘，姜 晶，趙廣鑫，李永超，桑 赫，韓雨桐

(1.吉林大學基礎醫學院,吉林 長春 130021;2.吉林省腫瘤醫院,吉林 長春 130012)

透明質酸(hyaluronic acid,HA)廣泛分布于細胞間質中，是細胞外基質的重要成員之一。近年來的研究表明，腫瘤細胞周圍富含HA，它們大多由腫瘤細胞表達產生。王玲研究顯示[1]，天然高分子量HA可抑制腫瘤細胞的生長，這可能與高分子量HA的理化性質有一定關系。此外，Ghatak等研究發現[2]，外源性低分子量HA(分子量約2.5×106Da)在體外可抑制小鼠TA3/st乳腺癌細胞、大鼠C6神經膠質瘤細胞、人HCT克隆瘤細胞及人LX1肺癌細胞生長，抑制率在50%～100%。而HA含量的多少對腫瘤生長同樣產生著影響。Bharadwaj等研究發現[3]，HAS3所致過量HA可能誘導并改變前列腺惡性腫瘤細胞生長所需的平衡。

人體內HA是由透明質酸合酶(hyaluronic acid synthase，HAS)與透明質酸酶(hyaluronidase，HAases)共同作用所形成的[4]。HAS是HA在生物合成過程中的關鍵酶。HAS的功能失調能夠導致HA合成下降，促進細胞和組織的生理過程向異常轉化。研究表明，在大腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌的腫瘤生長、侵襲、轉移過程中，HAS起到重要的作用[5]。HAases在腫瘤生長轉移過程中也起了重要作用。HAases通過降解腫瘤細胞周圍基質中的HA，幫助腫瘤細胞脫離原發腫瘤塊；其次，癌細胞還利用HAases降解淋巴和血管基底膜，更容易進入血管內；此外，HAases通過分解轉移灶附近的HA，為轉移灶的腫瘤細胞遷移與轉移提供空間。在所有的HAases分解HA過程中，都會不斷產生HA片段。這些HA片段刺激了內皮細胞增殖和新生毛細血管生長，從而促進了腫瘤的擴散[6-7]。

本研究擬通過給C57BL/6肺癌小鼠注射低、中、高三種分子量大小HA溶液，觀察不同分子量HA對肺癌小鼠體內腫瘤生長與轉移的影響，以探究HA作為注射劑抑制或治療部分腫瘤的可行性。

1 材料和方法

1.1 材 料

C57BL/6健康小鼠50只(SPF級)，雄性，6～8周齡，體重(21.15±0.75)g，長春生物制品所實驗動物室提供。小鼠Lewis肺癌細胞系(LLC)細胞，由吉林大學藥學院生物化學研究室提供。不同分子量大小的透明質酸鈉：0.2×106～0.4×106Da(低分子量)、1.3×106～1.5×106Da(中分子量)、1.8×106～2.2×106Da(高分子量)透明質酸鈉，由華熙福瑞達生物醫藥有限公司提供。本實驗所有切片圖片均采用EUROStarⅢPlus顯微鏡行顯微攝影。

1.2 肺癌小鼠模型的建立

消化、收集小鼠LLC細胞，離心，去上清，無菌生理鹽水洗滌2～3次，制成LLC細胞懸液。將此細胞懸液以0.2 mL/只(細胞含量1×106/mL)分別注入50只健康雄性小鼠大腿右側腹股溝皮下。注射后小鼠正常飼養21 d，形成米粒大小的腫瘤，第22天開始為小鼠注射HA，注射HA溶液濃度1 g/L[8-9]。

1.3 肺癌小鼠皮下注射HA

將培養的肺癌小鼠模型50只，隨機分成低(HA1)、中(HA2)、高(HA3)分子量HA組,生理鹽水(NS)組和無注射(CK)組，每組10只。前3組分別在肺癌小鼠右側腹股溝腫瘤團塊的近心端皮下注射低、中、高分子量HA溶液，NS組也于腹股溝處注射生理鹽水0.2 mL，每3天注射1次，CK組不進行任何處理。每次給藥后稱量體重，觀察注射局部有無異常狀況。第25天處死所有動物，對小鼠的肝、肺、腦、腎以及腫瘤取材、稱重。

1.4 小鼠腫瘤生長和轉移情況觀察

將所取材料投入4%中性甲醛固定24 h。固定后，常規石蠟包埋、切片。切片厚度 5 μm，備用。取上述切片行常規HE染色,并分別進行胱天蛋白酶(caspase)-3、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、HAS2和HAases2免疫組織化學染色。顯微鏡觀察所有腫瘤切片的免疫組化結果，并根據鏡下觀察的陽性情況將結果分為3級：零級(陰性)記0分、一級(陽性)記1分、二級(強陽性)記3分。以評分的高低顯示一個組整體的陽性情況,陽性分數=(b+3c)/(a+b+c)，公式中a、b、c分別代表一組中零級、一級、二級例數。

1.5 統計學分析

采用SPSS 19.0統計軟件進行t檢驗和卡方檢驗。當數據例數足夠多時用Pearson卡方分析，當數據例數少或出現個別例數為0時采用Fisher的精確檢驗。P<0.05具有統計學意義。

2 結 果

2.1 各分子量HA的刺激性觀察

在小鼠右側腹股溝皮下注射各分子量HA，48 h后觀察局部組織并未出現充血、水腫及硬結等異常變化。提示各分子量HA溶液濃度為1 g/L時安全、無毒性。

2.2 肺癌小鼠主要臟器重量和臟體比

與NS組相比，HA1組和HA3組的肝重量顯著增高(P<0.05)，HA3組的肺重量顯著增高(P<0.05)，HA3組肝的臟體比顯著增高(P<0.05)。其他各組臟器重量和臟體比無顯著差異(P>0.05)。

2.3 肺癌小鼠腫瘤轉移情況

采用下列評分法進行肺癌小鼠體內腫瘤轉移分析：無轉移(轉移灶數量為0)、普通轉移(轉移灶數量小于2)和重度轉移(轉移灶數量大于2)。結果顯示：NS組中9例普通轉移，1例重度轉移，轉移率27.8%；HA1組中7例普通轉移，3例重度轉移，轉移率27.8%；HA2組中11例普通轉移，2例重度轉移，轉移率28.1%；HA3組中14例普通轉移，6例重度轉移，轉移率55.6%。HA3組腫瘤轉移顯著高于NS組(P<0.05)，HA1組與HA2組皆與NS組無顯著差異(P>0.05)。

器官轉移主要行肝轉移，NS組5例普通轉移，1例重度轉移，重度轉移率11.1%;HA1組肝臟5例普通轉移，3例重度轉移，重度轉移率33.3%;HA2組7例普通轉移，2例重度轉移，重度轉移率22.2%;HA3組2例普通轉移，6例重度轉移，重度轉移率66.7%。HA3組腫瘤轉移情況比NS組嚴重，兩者相比有統計學意義(P<0.05)。且高分子量HA促進肝轉移，而對肺和腎無顯著影響(圖1)。

圖 1 各組腫瘤生長轉移情況

2.4 肺癌小鼠腫瘤生長狀況

肺癌小鼠腫瘤組織的PCNA免疫組化(圖2)評分統計結果顯示：HA2組陽性程度顯著低于NS組(P<0.05，圖3)。HA1組和HA3組皆與NS組無顯著差異(P>0.05)。

肺癌小鼠腫瘤組織的caspase-3免疫組化(圖4)評分分析結果顯示：各種分子量大小HA在一定程度上都可以促進部分腫瘤細胞的凋亡(圖5)。

2.5 肺癌小鼠腫瘤周圍HAS2與HAases2分析

肺癌小鼠腫瘤組織的HAS2免疫組化評分結果顯示：高分子量HA在一定程度上抑制了腫瘤周圍HAS的合成(圖6、7)。

肺癌小鼠腫瘤組織的HAases2免疫組化評分統計分析結果顯示：各分子量大小HA對腫瘤周圍HAases的合成并不產生太大影響(圖8)

2.6 HAS2染色陽性分數和腫瘤轉移率對比

HA3組HAS2陽性分數最低、CK組和NS組最高，提示：高分子量組的HA合成最少，而轉移率最高(見圖9)。

圖 2 各組腫瘤組織PCNA染色

圖 3 各組腫瘤PCNA染色陽性程度

圖 4 各組腫瘤組織caspase-3染色

圖 5 各組腫瘤caspase-3染色陽性程度

圖 6 各組腫瘤組織PCNA染色

圖 7 各組腫瘤PCNA染色陽性程度

圖 8 各組腫瘤組織caspase-3染色

圖 9 各組HAS2染色陽性分數和腫瘤轉移率對比

3 討 論

近年來研究表明，HA的含量和分子量大小對癌癥的治療有重要意義。Yamada等研究發現[10]，HA的作用可能與其調節細胞的黏附、運動、生長和分化有關。Bharadwaj的研究結果提示：HAS3上調所致的過量HA可能誘導改變前列腺惡性腫瘤細胞生長所需的平衡。因此，HA分子量大小、腫瘤周圍含量的多少，均影響腫瘤的生長與發展。

為探究HA治療或抑制部分腫瘤的可行性，本研究采用了皮下注射不同大小分子量HA溶液的方法觀察肺癌小鼠體內腫瘤在實驗過程中的生長與轉移情況。

腫瘤的生長是腫瘤細胞的增殖和凋亡綜合的結果：當細胞增殖大于凋亡時，表現為腫瘤生長，反之，則抑制腫瘤生長。在腫瘤生長到一定程度時，會出現腫瘤的轉移。

腫瘤細胞生長的分析顯示：中分子量HA增殖小于凋亡，很好地抑制了腫瘤的生長；而高分子量HA增殖和凋亡相近，對腫瘤生長的抑制作用不明顯。所以，從抑制腫瘤生長效果的角度來看，高分子量HA是不及中分子量HA的。

各分子量大小HA的注射，對于腫瘤細胞轉移的影響也變得不同。腫瘤細胞轉移的結果顯示：皮下注射高分子量HA的小鼠，其體內發生了更多腫瘤細胞的轉移。從單個器官來看，高分子量HA可能促進了腫瘤細胞向肝臟甚至其他臟器的轉移，并且加重了各個臟器的腫瘤轉移嚴重程度。故而外源性高分子量HA對腫瘤不存在治療和抑制效果，甚至有可能促進了腫瘤的生長與轉移。

HA的產生與腫瘤的轉移也存在一定的聯系。從對腫瘤細胞周圍HAS2的分析顯示：腫瘤的轉移率的增高，與HAS2表達的減少是有著一定相關性的，但這種相關性的機制還并未確定。

綜上所述，本實驗通過對一系列HA溶液皮下注射的研究，發現了中分子量HA相比于其他兩種分子量HA，有著良好的抑制腫瘤生長效果，同時也不會促進腫瘤細胞向其他臟器部位的轉移。中分子量HA作為細胞外基質成分,具有無毒、安全性高、結構明確、易于生產和價格便宜等特點。因此本研究提示，中分子量HA可以作為一種新的腫瘤治療研發方向。但同時，現階段的研究也存在著局限性。本實驗只將HA皮下注射到已有腫瘤的部位周圍，而并未探究現實情況中大多數腫瘤生長部位的隱蔽與復雜狀況，這為HA的注射與應用帶來了挑戰與困難。下一步工作將研究中分子量HA可否通過靜脈注射，依靠血液抵達目標位置產生作用與效能。