清熱涼血方對急性放射性腸炎大鼠一般狀況及MDA、SOD表達的影響

吳 超，何新穎，畢建強，孫云川△

(1. 華北理工大學中醫學院，河北 唐山 063700； 2.河北省滄州中西醫結合醫院，河北 滄州 061000)

近年來，放療在腫瘤綜合治療中的地位日漸突出，尤其作為腹盆腔惡性腫瘤的主要治療方法之一，在病灶的局部控制及患者生活質量改善等方面發揮著重要作用[1-2]。隨著腹盆腔腫瘤患者的增多，放射性腸炎的發生率也隨之增加。本研究擬通過觀察清熱涼血方對急性放射性腸炎大鼠模型的治療效果，對比急性放射性腸炎大鼠用藥后血液中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)表達的變化情況，探討清熱涼血方治療急性放射性腸炎可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD雄性大鼠60只，體質量(220±20)g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。標準鼠飼料喂養，持續12 h明暗交替日光燈照明，室溫20～25 ℃，濕度 40%～70%，自由活動與飲水。

1.2 試劑與儀器

中藥組成：白頭翁、秦皮、黃柏、敗醬草、地榆、紫草、生甘草、馬齒莧(由醫院中藥房提供，藥劑制備：分2次加水共500 ml，濃縮取汁，每毫升含生藥約3 g)；地塞米松片(廣東華西藥業有限公司，批號H44024469，規格0.75 mg/片)。MDA試劑盒及T-SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號A001-1);甲醛(成都市科龍化工試劑廠) 水合氯醛(購自成都市科龍化工試劑廠)。simensPRIMUS直線加速器；臺式冷凍離心機(Eppendorf公司，TGL-18R，醫院實驗室提供)。

1.3 方法

1.3.1 制作模型 所有大鼠適應性喂養3 d，禁食禁水12 h后稱重按隨機數字表法分為2組，其中正常組8只，造模組52只。造模組采用10%水合氯醛麻醉(給藥標準：2.5 ml/kg)，麻醉后固定，采用simens6MV直線加速器對上述大鼠進行照射，照射范圍(胸骨劍突至肛門外緣)，100 cm源皮距，行單次照射200 cGy/min，總體照射劑量12 Gy[3]，照射前8 h禁食禁水，建立大鼠急性放射性腸炎模型。造模成功判定標準[4]：大鼠受照射后1 d內吐黃水或出現黏液便、血便等大便性狀改變或出現其他放射性損傷癥狀。出現癥狀之后，隨機從造模大鼠中選取2只脫頸椎處死，剖取一段小腸縱軸剪開，0.9%生理鹽水沖洗后行甲醛固定、酒精脫水、石蠟包埋、HE染色、封片等處理后，光學顯微鏡下觀察大鼠小腸組織改變，確認造模成功。記錄大鼠照射后體質量、精神狀態及大便次數和性質。

1.3.2 分組 根據隨機數字表法將急性放射性腸炎動物模型50只隨機分成模型組、西藥對照組、中藥灌胃組、中藥灌腸組、中藥灌胃+灌腸組每組各10只，未造模大鼠8只為正常組。

1.3.3 給藥 根據人與動物體表面積換算法確定每只大鼠灌胃或灌腸的原藥劑量。將自擬清熱涼血組方煎制成湯劑，按照2 g/kg體質量的劑量和各自給藥方式分別給予3個中藥組，灌胃+灌胃組給予2份同等劑量中藥，分別用于灌腸與灌胃。西藥對照組給予相應劑量的地塞米松，正常組和空白模型組給予等量生理鹽水，隔日1次，連續治療4周。4周后大鼠處死，處死前1 d禁水禁食，大鼠麻醉，每只經腹動脈取血5 mL，血樣靜置2 h，用離心機2500 r/min離心15 min，取上清液，-20 ℃保存，待測超氧歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量。

1.4 觀察大鼠一般情況及體質量變化

觀察并記錄給藥期間模型大鼠的體質量、精神狀態、進食水及排便等情況變化，每周稱取各組大鼠體質量1次，記錄大鼠癥狀緩解及死亡情況。

1.5 制定療效評定標準

表1示，參照炎癥性腸病生活質量指數(IBDQ)和臨床結腸炎活動指數(SCCAI)[5]制定如下療效評定標準。

表1 炎癥性腸病療效評定標準

1.6 SOD活性測定及外周血MDA檢測

采用超氧歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)ELISA檢測試劑盒，嚴格按照操作說明進行，在酶標儀上檢測并分析其含量。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠一般情況及體質量變化

表2示，造模成功后模型組大鼠在第2～4天放射性損傷癥狀表現最嚴重，如吐黃、黏液便或稀爛血便，甚至出現不進食和水的情況。治療組癥狀較輕，造模各組大鼠體質量無明顯差異(P>0.05)。所有治療組大鼠7～10 d精神狀態、進食水等出現好轉，模型組仍有不同程度的黏液便或稀爛便。治療4周后，各治療組大鼠體質量較模型組明顯升高(P<0.01)，中藥治療組體質量高于西藥對照組(P<0.05)，中藥治療組之間比較差異無統計學意義。實驗過程中共有3只大鼠死亡(其中對照組1只，灌胃組1只，灌腸+灌胃組1只)。治療組大鼠死亡原因可能為灌胃針刺破正常組織管腔、組織間隙感染致死。

2.2 治療組總體療效比較

表3示，西藥對照組相關癥狀緩解較快，但整體緩解率低于中藥組，差異有統計學意義(P<0.05)，中藥治療各組間比較差異無統計學意義。

2.3 清熱涼血方對急性放射性腸炎大鼠血液SOD活性及MDA含量影響

表4示，模型組給藥大鼠血液中SOD活性顯著低于正常組，MDA的含量顯著高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)；治療組大鼠血液中SOD活性高于模型組，MDA含量低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)；中藥治療組大鼠血液中SOD活性高于西藥對照組，MDA含量低于西藥對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，顯示清熱涼血方中藥療效優于地塞米松；中藥治療組SOD活性、MDA含量無明顯差異，顯示不同的給藥方式不會影響大鼠血液中SOD活性及MDA的表達。

注：與正常組比較：■P<0.01；與模型組比較：★P<0.01；與對照組比較：▲P<0.05

表3 根據SCCAI及IBDQ評分各治療組不同階段有效率比較

注：各治療組與模型組比較：★P<0.05；與對照組比較：▲P<0.05

表4 給藥4周后各組大鼠血液相關指標水平變化比較

注：與正常組比較：■P<0.05；與模型組比較：★P<0.05；與對照組比較：▲P<0.05

3 討論

放射性腸炎病變范圍可包括小腸、結腸、直腸[6]，盆腹腔惡性腫瘤經放射治療的患者發生幾率為10%～21%。末端回腸鄰近盆腔照射野且位置相對固定，是損害高發區，其中腸黏膜基底部和黏膜上皮細胞表現最為明顯[7]。而放療后引起的腸道組織損傷已經成為制約治療效果的主要因素。西藥治療放射性腸炎副反應大，病情易反復，中醫藥治療具有副反應小、并發癥少等優點。與此同時，推廣使用中藥組方，在實用性與經濟性方面適合中國國情[8]。

現代中醫學認為放射線屬于熱毒，熱毒與濕邪在腸道相互裹挾，致使腸道氣血壅滯，傳導失司，故而出現腹痛、肛門重墜、里急后重等癥狀。濕熱毒邪灼傷腸道陰絡，導致腹瀉、黏液便或便血等。清熱涼血方中紫草甘寒，清熱解毒；白頭翁歸大腸經，善清胃腸濕熱，二者共用涼血清熱，直折放射熱毒為君藥；生地榆功在清熱、涼血、生肌，治療便血效果上佳；黃連善除脾胃及腸道濕熱，黃柏主入下焦，槐角清熱瀉火，四者為臣協助君藥引藥直趨病所，直達腸道。生甘草、白芍酸甘化陰，能夠緩解熱毒所致陰津損傷，甘草又可調和藥性，諸藥合用共奏清熱解毒涼血之功。現代藥理學亦表明，白頭翁中含有的三萜類化合物、木脂素及白頭翁皂抗炎作用顯著[9]，硬紫草羥基萘醌提取物可抑制TNBS誘導的腸道炎癥反應[10]。陳紅宇等[11]測定地榆提取物對O2-和OH-清除作用的實驗證實，地榆提取物具有清除自由基的作用，清除效果與濃度成正比。黃芪具有顯著抗氧化作用，能夠抑制過氧化脂質反應[12]。

本實驗研究結果顯示，清熱涼血方可以改善急性放射性腸炎大鼠的精神狀態及黏液便、血便等腸道損傷，中藥灌腸、灌胃、灌腸+灌胃3組大鼠的癥狀改善率及血液學指標均未見明顯差異(P<0.05)。藥物口服是目前基本給藥方式之一，臨床操作簡單易行，患者易于接受，療效相對穩定，是本實驗推薦的給藥方式。

研究表明，腸道組織局部炎癥反應與氧自由基密切相關[13]。氧自由基生物特性活潑，氧化性強，是細胞活動代謝的副產物，對人體損傷極大[14]。高能射線照射使機體處于應激狀態下，致使細胞代謝明顯增高，超氧離子(O2-)、羥自由基(OH-)等高活性氧產生增多，氧化作用增強，過多的氧自由基攻擊生物結構膜上的不飽和脂肪酸，從而引發脂質過氧化反應(LPO)，破壞膜的正常結構，改變其流動性，導致穿孔等氧化應激性損傷。丙二醛(MDA)等脂質過氧化產物，也能夠讓組織中細胞膜結構損傷、蛋白質變性和DNA損傷。同時，過多的氧自由基可引起氨基酸殘基突變，致使蛋白質的生物特性改變，加速氧化降解進而影響到細胞蛋白質的合成與功能。DNA雙螺旋外側嘧啶和嘌呤同樣對自由基敏感，過多的氧自由基能夠使DNA鏈結構斷裂，引發細胞凋亡。測定組織中的MDA的含量，不僅可以間接反映組織中氧自由基生成量，而且同時也反映組織生物膜脂質過氧化的程度和組織膜結構受損程度[15]。與此同時，機體擁有完整的抗氧化系統。其中酶促防御系統可通過產生過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)等清除氧自由基，中斷鏈鎖反應，使氧自由基產生和清除實現動態平衡。非酶促防御系統和機體自我修復系統也能夠減少氧自由基對機體的損壞。通過檢測SOD，其結果可間接反映結腸組織清除氧自由基的能力[16-17]。氧自由基在體內存在時間極短，難于直接檢測，但可通過檢測血液中MDA含量及SOD活性，間接測定體內氧自由基活性水平，判斷組織細胞的損傷程度。

實驗結果表明，清熱涼血方可降低急性放射性腸炎大鼠機體中丙二醛含量，提高超氧化物歧化酶活性，清除氧自由基，抑制脂質過氧化反應，減輕腸黏膜過氧化作用，加快腸道組織損傷修復，此項研究為清熱涼血方的臨床應用提供了更為可靠的實驗依據。