真武湯和越婢湯對阿霉素腎病大鼠AQP1/AQP2的影響?

宋純東，宋 丹，賈評評，陳 瑤，花淑婷，劉玉讓，馬金玉

(1. 河南中醫藥大學第一附屬醫院，鄭州 450000； 2. 河南中醫藥大學，鄭州 450000)

原發性腎病綜合征(nephrotic syndrome，NS)是臨床常見的腎小球疾病，水液代謝失衡引起的高度水腫和少尿為其最突出的臨床特征。腎臟作為水液代謝的主要器官，直接參與整個NS的病理生理過程，腎小球濾過和腎小管重吸收都出現不同程度的功能改變，目前備受關注的水通道蛋白(aquaporins，AQPs)在這一病理生理過程中起舉足輕重的作用[1]。離體實驗證明，水通道蛋白1(aquaporin-1，AQP1)缺失導致近曲小管和亨利袢降支細段的滲透性及重吸收能力降低，逆流倍增系統遭破壞[2]。水通道蛋白2(aquaporin-2，AQP2)是腎臟集合管柱狀上皮細胞內最重要的水通道蛋白，在腎小管濃縮、重吸收功能中起關鍵作用[3]。病理情況下(如腎炎、低血鉀等)可引起AQP2總量或頂膜表達減少，從而導致多尿[4]。

現代醫學采用噻嗪類、袢利尿劑等對癥治療，利尿作用療效顯著。相關研究證實，與利尿劑調節腎小管上皮細胞AQPs 的表達相關[5]，但這種姑息治療療效短暫，并容易引起水電解質失衡。中醫藥治療水腫分別給予宣肺、健脾、補腎等不同治法，臨床療效肯定，尤其是經方真武湯、越婢湯等廣泛應用于水腫治療，其臨床療效及作用機制已得到眾多研究證實[6-9]。為探討兩方對阿霉素腎病模型大鼠腎組織AQP1、AQP2的影響及其差異，現進行如下實驗。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑

真武湯顆粒組成：附子9 g，白術6 g，茯苓9 g，芍藥9 g，生姜9 g，共42 g；越婢湯顆粒組成：麻黃12 g，石膏25 g，生姜9 g，甘草6 g，大棗30 g共94 g，均由四川新綠色藥業科技有限公司提供并加工為顆粒劑。注射用鹽酸阿霉素(批號90L0138，浙江海正藥業股份有限公司)；SA 1020免疫組化試劑盒、兔抗大鼠AQP1、AQP2抗體(博奧森生物科技有限公司)、DAB顯色劑等。

1.2 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠48只(購于河南省動物實驗中心，合格證號SCXK(豫)2015-0004)，體質量(200±20) g。實驗動物飼養于河南中醫藥大學第一附屬醫院中心實驗室，室溫(23±2)℃，濕度(45±2)%，自由飲水，普通飼料。本實驗已通過河南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物倫理委員會審查。

1.3 造模、分組及干預方法

大鼠適應性喂養1周后，按隨機數字表法分為空白組12只，對照組36只。參照文獻[10]造模方法，對照組第1次經尾靜脈注射阿霉素4 mg·kg-1·d-1，間隔1周后再次注射2 mg·kg-1·d-1，空白組注射等量生理鹽水。于第2次注射2周后對照組與空白組比較，尿蛋白升高有統計學意義，視為造模成功[11]。此時將對照組按隨機數字表法分為模型組、真武組和越婢組各12只并開始灌胃，真武組按4.41 g·kg-1·d-1、越婢組按9.87 g·kg-1·d-1，空白組與模型組分別給予等量生理鹽水共6周。實驗過程中僅模型組大鼠死亡2只。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 大鼠一般情況 觀察大鼠實驗過程中精神、活動、皮毛、攝食、體質量及死亡等。

1.4.2 生化指標檢測 分別于第2次注射后第1周、第2周和第8周末，將大鼠放于代謝籠內禁食不禁水，收集24 h尿液，檢測24 h尿蛋白定量；灌胃第6周末用10%水合氯醛麻醉后腹主動脈采血2 ml，采用AU800自動生化分析儀(終點法)檢測血漿白蛋白(ALB)、谷丙轉氨酶(ALT)、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、總膽固醇(CHOL)及甘油三酯(TG)。

1.4.3 腎臟病理檢測 處死大鼠迅速摘取左側腎臟，去除被膜，沿腎門縱向切取1/2組織，所有標本經10%甲醛固定、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片(厚度為3～5 μm)后經HE染色，每組選取6個標本(×400)，顯微鏡觀察腎臟病理變化。

1.4.4 免疫組化法檢測腎臟AQP1、AQP2的表達 石蠟切片梯度脫蠟，PBS沖洗后放入枸櫞酸鈉溶液中入微波爐修復抗原，正常小牛血清封閉，滴加一抗，置濕盒中4 ℃過夜，第2天PBS沖洗后滴加二抗，37 ℃哺育30 min，PBS沖洗后滴加SABC，37 ℃哺育30 min，PBS沖洗后DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。應用Image-pro-Plus 6.0進行半定量分析，每組選8個樣本(×400)，每例樣本隨機選取10個視野輸入計算機進行分析，自動得出AQP1、AQP2免疫組化染色吸光度，并計算出陽性積分吸光度(IA)，陽性積分吸光度越大表明蛋白表達越強。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠一般情況

造模后3～5 d，對照組大鼠出現精神萎靡、活動量減少、攝食減少，并出現便溏、倦臥、反應遲鈍、皮毛枯黃脫落、體質量增長緩慢等，2周后出現四肢水腫、腹水明顯等。空白組大鼠精神、活動、皮毛及攝食等均無明顯改變。藥物干預后，大鼠癥狀減輕，水腫逐步消失。實驗過程中僅模型組大鼠死亡2只。

2.2 生化指標

2.2.1 24 h尿蛋白定量比較 表1示，第2次注射后2周末，模型組、真武組和越婢組24 h尿蛋白定量與空白組比較差異有統計學意義(P<0.05)，表示造模成功；第8周末，模型組、真武組、越婢組24 h尿蛋白定量均明顯高于空白組(P<0.05)；中藥2組24 h尿蛋白定量均明顯低于模型組(P<0.05)；但中藥2組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠第2次造模后第1周、第2周和第7周末尿蛋白定量比較

注：與空白組比較：ΔP<0.05；與模型組比較：▲P<0.05

2.2.2 各組大鼠血生化指標比較 表2示，藥物灌胃第6周末，模型組、真武組和越婢組與空白組比較ALB降低，ALT、Scr、BUN、CHOL和TG均升高(P<0.05)。與模型組比較，真武組和越婢組ALB升高，Scr、CHO和TG均降低(P<0.05)；ALT和BUN無明顯差異。越婢組與真武組比較，ALB、Scr、CHOL與TG各組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 各組大鼠腎臟病理形態學變化

圖1HE染色顯示，光鏡下空白組大鼠腎組織腎小球、腎小管及間質基本正常。腎病模型組可見部分腎小球肥大，少數腎小球系膜細胞和基質輕微增生，包氏囊增厚、球囊黏連，部分腎小管擴張或萎縮，少量蛋白管型，間質可見局灶性炎性細胞浸潤；真武組和越婢組腎臟病變明顯減輕。

表2 各組大鼠肝腎功能及血脂比較

注：與空白組比較：ΔP<0.05；與模型組比較：▲P<0.05

圖1 各組大鼠腎臟病理形態學變化(HE染色×400)

圖2 各組大鼠AQP1、 AQP2免疫組化結果比較(×400)

2.4 各組大鼠腎小管AQP1、AQP2的表達

表3圖2示，與空白組比較，模型組、真武組、越婢組值均下降(P<0.05)；與模型組比較，真武組、 越婢組值均升高(P<0.05)；越婢組與真武組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠腎臟AQP1、AQP2表達結果

注：與空白組比較：ΔP<0.05；與模型組比較：▲P<0.05

3 討論

阿霉素腎病模型是出現NS表現并伴有小管間質纖維化和腎小球硬化傾向的一個典型的實驗模型，在腎臟病研究領域應用廣泛[12]。初始阿霉素注射劑量與實驗大鼠死亡率明顯相關，本研究經預實驗后采用文獻報道[10]造模方法。

原發性NS最常見的臨床癥狀是少尿、水腫，甚至合并腹水、胸水等，治療過程中“利尿消腫”的對癥治療顯得尤為重要，一方面可以減輕患者痛苦癥狀，更為重要的是可以減輕胃腸道黏膜水腫，改善患者食欲，有利于藥物吸收。AQPs 廣泛分布于機體組織細胞，以腎臟分布種類最多，在哺乳動物體內已經發現水通道蛋白家族的13個成員，分別為AQP 0-12。AQP1是1988年發現的一種具有快速轉運水的蛋白質分子，1993年AQP2被克隆確認。研究發現，西藥利尿劑治療NS水腫機制與調節AQPs表達有關[13]。AQP1位于腎臟近曲小管及亨利袢降支的頂質膜與側膜上，主要介導原尿中水分的重吸收。離體實驗證明， AQP1缺失導致近曲小管和亨利袢降支細段的滲透性及重吸收能力降低，逆流倍增系統遭破壞[14]。AQP2是腎臟集合管(inner meullary collecting duct，IMCD)柱狀上皮細胞內最重要的水通道蛋白，在腎小管濃縮、重吸收功能中起關鍵作用[15]。病理情況下(如腎炎、低血鉀等)可引起 AQP2總量或頂膜表達減少，從而導致多尿[16]。AQP2主要分布于集合管主細胞的管腔側質膜及細胞內囊泡內，腎臟集合管細胞通過AQP2調控水的重吸收進而調控機體的水代謝平衡[15]。

越婢湯最早出自《金匱要略·水氣病脈證并治》：“風水惡風，一身悉腫，脈浮而渴，續自汗出，無大熱，越婢湯主之”，具有疏散水濕、宣肺清熱的功效，治療以面目浮腫為主的風水證；真武湯出自《傷寒論》，是為治少陰陽虛水泛而設的名方，其溫腎陽、利水氣的功用，在臨床應用中每獲良效，二者均為治療水腫的經方。

水通道蛋白尤其是AQP2的發現及其與尿液重吸收密切關系，使得中醫藥調節水液代謝機制的相對直觀成為可能[16]。有國內研究發現，具有溫陽利水作用的真武湯治療阿霉素腎病的機制可能與調節腎臟AQP2表達、維持正常腎小管結構和腎臟水液代謝功能有關[17]；通過下調 AQP1、AQP2的表達來減少水的轉運與重吸收，減輕水腫[18]。具有宣肺利水作用的越婢湯可改善阿霉素腎病大鼠腎小球超微結構，修復腎小球電荷屏障[7]。

本研究采用經方真武湯和越婢湯同時干預阿霉素腎病大鼠，以觀察生化、病理及腎組織AQP1、AQP2表達的影響。結果顯示，真武組、越婢組與模型組比較白蛋白升高，而24 h尿蛋白定量、Scr、CHO和TG均降低，ALT和BUN無明顯差異，腎臟病理改善，AQP1、AQP2在腎組織表達水平升高。真武湯和越婢湯相比，ALB、Scr、CHOL和TG各組差異無統計學意義。同時發現，各種生化指標及腎臟病理改善與腎組織AQP1、AQP2在腎組織表達水平呈正相關。上述結果提示，真武湯和越婢湯可能通過上調腎組織AQP1、AQP2的表達水平，而發揮利水、降低蛋白尿、保護腎功能、改善腎臟病理的作用。此可能是中醫“同病異治”分子基礎及中藥不同利水法的共同療效機制之一。

各種觀察指標在真武組與越婢組比較中差異均無統計學意義，究其原因可能與用藥過程檢測指標間隔時間過長，不能階段性地反映中藥不同治療方法在不同時期的優勢有關。越婢湯主要用于NS中醫辨證為風邪襲表，病理相當于“微小病變”型(MCD)，水腫初始階段療效明顯，其利水作用可能與重點影響近曲小管和亨利袢降支AQP1表達有關；真武湯主要用于難治性NS反復發作，病變后期傷及脾腎之陽(氣)，病理多為“局灶節段增生性”(FSGS)型改變為主，其利水作用可能與重點影響集合管AQP2的表達為主。在整個實驗過程中，如果增加動物數量，每周都進行相關生化檢查、病理及免疫組化檢測，可能會發現不同疾病階段兩方有不同的作用。由于經費等原因沒有分階段觀察，最終兩方的實驗結果基本一致。總之，2個經方體現了2種不同的治法，但對水液代謝的作用均是通過對 AQPs的調節來實現的。觀察中藥不同利水法“同病異治”阿霉素腎病的療效及機制有待進一步的深入研究。