不同時間電針頭穴預處理對MCAO大鼠腦皮質MicroRNA-210表達的影響?

梁 超，鮑春齡，姜 濤，張燕珍，陳邦國

(1. 海口市中醫醫院，海南 海口 570216； 2. 湖北中醫藥大學針灸骨傷學院,武漢 430000)

缺血性腦血管病是一種致殘率極高的疾病，據估計該病3/4的患者有不同程度的勞動能力喪失，其中重度殘疾約占40%[1]。上個世紀90年代就有研究證明，缺血預處理能增加人體組織缺血、缺氧耐受以減輕缺血疾病后組織的損傷。近年來，從該病的流行病學角度來看，該病的積極預防意義遠大于該病的治療[2]，因此越來越多的研究關注于針灸預防缺血性腦血管疾病的發生發展[3-4]。MicroRNA-210是一種重要的內源性非編碼小RNA，也是缺氧特應性的MicroRNA[5]，它參與缺血缺氧后血管形成的過程，但是其表達對腦缺血血管新生的影響作用尚不清楚。因此本研究以電針為立足點，觀察不同時間電針預處理對局灶性腦缺血大鼠局部腦皮質中MicroRNA-210表達變化及微血管內皮細胞的影響，初步探討電針預防急性腦血管病的相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康成年SD大鼠60只(湖北省實驗動物研究中心提供，許可證號SCXK(鄂)2015-0018)，雌雄不拘，體質量(200±20) g。于實驗前1周一次性購進，飼養于安靜、溫暖且避強光的環境中，室溫(20±2 ℃)，自由飲水飲食。

1.2 主要試劑與儀器

Ki-67抗體(abcam)、濃縮型正常山羊血清(封閉)、熒光(Cy3)標記羊抗兔IgG(均購自武漢博士德生物工程有限公司)、抗熒光淬滅封片劑(碧云天生物科技有限公司)等。病理切片機(德國Leica RM 2016輪轉式切片機)、熒光顯微鏡(NIKON Eclipse 80i生物顯微鏡)、實時熒光定量PCR儀(ABI7900 / illumina eco)、分光光度計(上海舜宇恒科學儀器有限公司)、PCR儀(東勝創新生物科技有限公司)等。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及處理 60只SD大鼠采用隨機數字表法分為正常對照組、模型組、安慰針刺組、電針預處理5 d組、電針預處理10 d組、電針預處理15 d組，每組大鼠各10只。正常對照組大鼠不予處理，正常給水給食；模型組大鼠按要求制備MCAO模型；安慰針刺組大鼠安慰針刺15 d后制備MCAO模型；電針預處理各組分別針刺治療5 d、10 d、15 d后制備MCAO模型。

1.3.2 動物模型制備 參照Longa[6]線栓法加以改進，制備MCAO模型。大鼠造模前禁食不禁水24 h，稱重并以10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉；仰臥固定于手術臺，常規備皮消毒，頸部正中切口，鈍性分離皮下筋膜和肌肉，暴露并分離出右側頸總動脈(common carotid arternal,CCA)、頸內動脈(internal carotid artery,ICA)、頸外動脈(external carotid artery,ECA)。電凝ECA的分支，結扎游離ECA主干，分離ICA主干至翼腭動脈(pterygo palatine artery,PPA)，并在其起始部和CCA的近心端各置一動脈夾。將ECA殘端輕拉向下剪0.2 mm小口，輕推尼龍線尾端經CCA分叉部沿ICA入顱，至大腦中動脈(middle cerebral artery,MCA)，在線栓經MCA和PPA分叉處時用玻璃分針調整方向，以便線栓順利進入MCA。尼龍線插入深度由CCA分叉部計約18 mm。栓塞60 min拉出尼龍線，使血流再灌。縫合切口，消毒。手術后大鼠室溫下禁食給水喂養，蘇醒后進行神經功能障礙評分以判斷是否造模成功。只有神經功能障礙在1級以上的大鼠才能保留下來。

1.3.3 治療方法 電針預處理組大鼠取健側百會透曲鬢、百會透懸厘進行治療。取穴標準及針刺深度參照中國針灸學會實驗針灸研究會華興邦[7]等制定的《常用動物腧穴圖譜》標準及《頭皮針穴名國際標準化方案》[8]。百會為頂骨正中點，曲鬢為耳緣直上與耳尖水平線的交點，懸厘為頭維穴與曲鬢穴弧形連線的上3/4與下1/4交點處；選用30號1寸一次性無菌針灸針，分別從頂骨中點向耳根前與頭皮呈15°夾角透刺0.5～0.8寸，在2組穴位的連線上接力式刺3針，快速捻轉200 r/min以上，捻轉2 min后接LH202H型韓氏儀，采用疏密波頻率2 Hz/100 Hz，強度1 mA，每次持續刺激30 min。安慰針刺組采用套迭式頓頭安慰針，底座固定于穴位處，左手固定針管，右手快速叩擊頓頭安慰針，局部皮膚針刺感但不刺入皮膚，不予加電刺激；安慰針刺組連續治療15 d后造模；電針預處理5 d組、10 d組和15 d組分別用以上電針方法連續治療5 d、10 d、15 d后分別造模，大鼠均在造模成功后24 h內進行評分、取材。

2 觀察指標及方法

2.1 神經功能缺損評分(NSS)

各組大鼠分別在造模清醒后參照Longa的5級神經功能評分標準進行評估。1級: 左前肢不能充分伸展，計1分；2級: 向左環形運動，輕度局灶神經功能缺失，計2分；3級:向左側倒，中度局灶神經功能缺失，計3分；4級:不能自然行走，重度局灶神經功能缺失，計4分。

2.2 血管內皮細胞增殖數目

采用免疫熒光法檢測中微血管內皮細胞增殖數目。大鼠灌注后迅速取腦，所取組織脫水、包埋、切片，然后進行切片脫蠟和抗原修復10～15 min，用PBS(pH7.4)沖洗切片3遍，每次3 min；滴加稀釋好的正常山羊血清，室溫封閉30 min，然后滴加稀釋好的一抗(1∶200)，加完一抗后于4 ℃濕盒中孵育過夜；PBST沖洗切片3次，每次3 min，滴加稀釋好的熒光二抗，20～37 ℃孵育1 h，PBST沖洗切片4次，每次3 min；在暗處滴加DAPI避光孵育5 min進行染核，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI；用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。結果判定，ki67免疫熒光染色以細胞核出現紅色或橙紅色顆粒為陽性細胞；在高倍(×400)光學顯微鏡下隨機選取5個視野，計算缺血皮質中ki67標記的陽性細胞數，并計數平均值為血管內皮增殖細胞數目。

2.3 實時熒光定量PCR檢測MicroRNA-210表達

造模24 h后用10%水合氯醛麻醉大鼠，斷頭取腦保存于-80 ℃冰箱。按照TRizol說明書中的方法提取腦缺血組織中總RNA。在20 μL反轉錄反應體系中，以1 μL RNA為模板將mRNA反轉錄為cDNA。PCR反應以U6為內參，U6上游引物序列：5′- CGCTTCGGCAGCACATATAC -3′，下游引物序列：5′- AAATATGGAACGCTTCACGA -3′；MicroRNA-210引物序列：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATAC GACTCAGCCGC-3′；反應體系為20 μL，擴增結束后，PCR產物的定量校正和判定分析采用U6作為內參照，用U6的拷貝數作為校正基數，通過各樣本中MicroRNA-210的CT(cycle threshold)值，分別與對應樣本中U6的CT值相減，即獲得MicroRNA-210的△CT值；分別以模型組的△CT值作為校正得出-△△CT值，2-△△Ct公式計算出各樣本中MicroRNA-210的表達。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 神經功能損傷評分(NSS)結果

缺血后各組大鼠神經功能損傷評分均升高，模型組與安慰針刺組比較差異無統計學意義(P>0.05)，電針預處理后NSS分值低于模型組和安慰針刺組，電針預處理15 d組分值最低(P<0.01)。

3.2 血管內皮細胞數目比較結果

安慰針刺組微血管內皮細胞數與模型組的區別不大(P>0.05)，各預處理組比安慰針刺組的細胞數目均多(P<0.05)，且電針預處理15 d組細胞增殖數目最多(P<0.01)。

3.3 MicroRNA-210表達比較

安慰針刺組MicroRNA-210表達量與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)；預處理后MicroRNA-210相對表達較安慰針刺組明顯減少(P<0.05)；電針預處理5 d組較其他2組的表達量多(P<0.01)，電針預處理10 d組與預處理15 d組間表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)。

4 討論

腦卒中發生后氣機逆亂，導致竅閉神匿，神不導氣，留滯陳瘀。若氣血盛則經脈通，正氣得以扶助，瘀血得以祛除，血絡得以新生，腦髓氣化向愈，機體功能逐漸恢復。頭穴治療中風病早就被肯定和記載。《針灸大成·玉龍歌》中說：“中風不語最難醫，發際頂門穴要知，更向百會明補瀉，即時蘇醒免災難。”在《針灸大成·卷八·中風癱瘓針灸秘訣》中亦明確指出：“百會、耳前發際”為治療中風風邪入腑以致手足不遂的要穴。《普濟方》記載：“凡忽中風言語騫澀，半身不遂……穴百會，耳前發際(曲鬢穴)……神效。” 頭為諸陽之會，氣血聚集之要，“病變在腦、首選督脈”為歷代醫家的共識[9]。于志順也提出，中風后出現的肢體偏癱及功能障礙，選用從百會、前至神庭、兩側至曲鬢的菱形區內效果較好[10]。本研究選用百會穴調節全身各經脈之經氣，通暢氣血，充盛腦髓，上榮于腦；曲鬢為足少陽、太陽之會，懸厘為手足少陽、陽明之會，三穴同刺可直接鼓動經氣暢行，激發臟腑之氣疏通閉阻，達到“旺盛氣血、去瘀生新”的作用。課題組前期研究發現，“百會透曲鬢、懸厘”兩穴不僅能改善腦電活動，縮小梗死體積，減輕炎癥反應，抑制神經元凋亡，還在促進血管新生方面效果顯著[11-12]。進一步得出該穴位的透刺還能影響腦缺血后MicroRNA-210的表達，通過抑制作用減輕神經功能損傷。

表1 各組大鼠NSS、增殖內皮細胞數和 MicroRNA-210表達比較

注：NSS評分中，與正常對照組比較：*P<0.05；與安慰針刺組比較：△P<0.05；微血管內皮細胞數目與模型組比較：*P<0.05；與安慰針刺組比較：△P<0.01；MicroRNA-210表達與正常對照組比較：*P<0.05；與安慰針刺組比較：△P<0.05

預處理可以歸結于中醫“治未病”范疇，體現了“預防為主”的醫學思想，其潛在的機制可能涉及調節神經遞質、炎癥因子、腺苷等相關分子生物網絡信號通路傳導，以干預細胞周期中DNA自我修復/重塑機制等[13-14]。在腦缺血之前給予針刺刺激，誘導腦組織細胞對抗腦缺血缺氧而產生耐受，從而產生部分腦保護作用的處理措施，稱為針刺預處理[15]。對于急性腦梗塞而言，針刺預處理后可以不同程度地激活某些中介因子和信號通路的開放，促進血管新生，以增強機體對缺血缺氧的耐受效應，以減輕神經功能損傷[16-17]。如增加腦缺血大鼠骨髓和外周血中EPCs含量[18]，促進血腦屏障MMP-9陽性表達及VEGF mRNA的表達，以增強血管新生效應[19]。其具體機制目前沒有完全闡明，但MicroRNAs與其相關性研究逐漸成為熱點。

MicroRNAs(miRNAs)是近年來發現的一種重要的內源性非編碼小RNA(20～25個堿基)，在進化上高度保守，廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡、代謝及個體發育等生物學過程。其在缺血性腦血管疾病的發生發展過程中發揮著重要作用，與炎癥反應、神經元凋亡及血管新生均有關系[20]。 MicroRNA-210在急性腦缺血后水平顯著上調，在第3天和第7天達到高峰，這與體內缺血缺氧環境有關[21]。其高表達不光是在急性腦缺血的早期，而是在病理變化未發生時已啟動，從而在缺血超早期參與神經修復過程[22]。針刺對腦缺血后miRNAs的表達也具有調控作用，可以提高MiRNA-290、MiRNA-494表達，并降低AQP-4相對含量以減輕腦損傷[23]。本實驗造模后MicroRNA-210水平顯著上調，不同的是經過電針頭穴預處理后該基因的含量有所降低，特別是經過15 d治療后，MCAO大鼠的MicroRNA-210與正常組比較差異無統計學意義，說明電針預處理能明顯降低急性腦缺血后腦皮質中MicroRNA-210基因的表達。

局灶性腦缺血最主要的原因來自動脈粥樣硬化后栓子脫落所造成的腦動脈閉塞[24]，因此及時恢復或改善大腦的血液供應是中風后功能恢復的關鍵，而腦缺血后血流的恢復又依賴于局部血管的代償與新生[25]。無論是局部腦皮質微血管還是血腦屏障，血管的新生首先出現變化的都是內皮細胞。MicroRNA-210可以調控血管內皮細胞的存活、增殖、凋亡及細胞間的連接[26-27]。本研究發現，電針預處理能有效促進內皮細胞增殖，從結果可看出在預處理15 d組的增殖血管內皮細胞最多，此時的MicroRNA-210的表達最少，說明電針治療降低缺血后MicroRNA-210的表達，內皮細胞的增殖可能與此有關。因為在缺血后血管新生過程中，MicroRNAs具有2種不同的作用[28]，一種促血管生成，一種抗血管生成，在此研究中MicroRNA-210就屬于第一種。

綜上，電針頭穴預處理可使MACO大鼠的神經功能損傷得到改善，說明電針頭穴預處理提高了大鼠缺血缺氧耐受程度，抑制局部腦皮質中MicroRNA-210的基因表達以干預血管內皮細胞增殖，促進缺血后局部血液循環。這一作用可能是電針頭穴預防腦血管疾病的機制之一。