基于激光散斑對比成像技術的化痰通絡法對腦梗死大鼠腦血流的影響?

徐家淳，孫偉明，覃啟京，王 凱，程汝珍，李 強，紀 靖，周 震Δ

(1.天津中醫藥大學第二附屬醫院，天津 300150； 2. 天津中醫藥大學，天津 300193； 3. 廣西國際壯醫醫院，南寧 530201)

腦血流下降是腦梗死發生后最直接的表現，也是引起腦組織損害的根本原因[1-2]。腦梗死后缺血中心區缺乏血流供應，導致神經元不可逆性壞死；半暗帶血流灌注較低，但處于動態變化中，若能及時恢復血流供應，該區神經元可繼續存活并發揮功能，神經功能可恢復。因此，及時恢復血流供應，拯救半暗帶是治療腦梗死的關鍵。本課題組一直致力于化痰通絡法治療腦梗死的臨床和實驗研究，臨床中發現該法可有效改善腦梗死患者神經功能，提高日常生活能力[3-4]。實驗研究亦發現，該法能減少溶栓后再梗死，預防出血轉化，保護神經元[5-6]。本研究中課題組首次將激光散斑對比成像技術應用于觀察化痰通絡法改善急性腦梗死大鼠腦血流的動態變化，為揭示化痰通絡法治療腦梗死的作用機制提供部分實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級SD雄性大鼠27只，體質量240～260 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(合格證號SCXK(京)2012-0001)；大鼠均飼養于中國醫學科學院放射醫學研究所實驗動物中心12 h光照-黑暗交替，室溫23～25 ℃，相對濕度50%～60%。采用隨機數字表法將27只大鼠隨機分為假手術1 d、3 d、7 d組，模型1 d、3 d、7 d組，中藥1 d、3 d、7 d組，每組3只。造模前適應性喂養1周，食水自由。

1.2 主要試劑與儀器

生理鹽水(石家莊四藥有限公司)；水合氯醛(天津市致遠化學試劑有限公司)。

激光散斑成像系統(南開大學電子信息與光學工程學院)；T60電磨機(永康市奇創工貿有限公司)；腦立體定位儀(瑞沃德)。

1.3 化痰通絡法復方

化痰通絡法復方組成：天麻10 g，半夏10 g，丹參30 g，膽南星5 g，川芎10 g，地龍10 g，酒大黃5 g。將上述藥物400 g(5付)加水濃縮至500 mL，生藥濃度為0.8 g/mL，由天津中醫藥大學第二附屬醫院制劑中心制備，4 ℃冰箱保存備用。

2 方法

2.1 造模

2.1.1 造模時點 按照大鼠分組制備假手術組1 d、3 d、7 d大鼠，模型組1 d、3 d、7 d MCAO大鼠，中藥組1 d、3 d、7 d MCAO大鼠，每組每個時間點3只大鼠。

2.1.2 造模方法 本實驗參照Longa線栓法[7]將中藥組及模型組大鼠制備大腦中動脈栓塞(MCAO)模型：麻醉大鼠后仰臥位固定，備皮消毒頸部皮膚暴露左側頸總動脈(CCA)，沿CCA向上分離左側頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)，在CCA遠心端和近心端及ECA靠近分叉處掛棉線備用，微動脈夾暫時夾閉ICA，近心端結扎CCA、ECA，距CCA分叉5 mm處剪一小口，插入栓線至ICA微動脈夾處，松開動脈夾，棉線拴牢栓線，進栓距分叉處18 mm左右遇到阻力時停止進栓，系牢CCA遠心端的細線，常規清理并縫合手術創口，消毒手術切口皮膚。假手術大鼠僅暴露并分離頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈不進栓，所有實驗大鼠術前禁食24 h。

2.2 灌胃

2.2.1 灌胃時點 1 d組大鼠在造模結束大鼠蘇醒后灌胃1次，3 d組大鼠每日灌胃1次共3次，7 d組大鼠每日灌胃1次共7次。

2.2.2 灌胃方法 造模成功后，各組均采用灌胃給藥。中藥給藥劑量參照《藥理實驗方法學》[8]中“人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表”計算，中藥組大鼠按照7.2 g/kg灌胃，假手術組及模型組大鼠采用與中藥組相同劑量的蒸餾水在相同時間點灌胃，每日1次。

2.3 激光散斑對比成像技術檢測腦血流變化

本實驗參照Joseph S. Paul等[9]方法，利用激光散斑對比成像技術觀察MCAO模型大鼠缺血半暗帶腦血流變化。

2.3.1 檢測時點 1 d組大鼠在造模后24 h、3 d組大鼠在造模后72 h、7 d組大鼠在造模后7 d分別進行腦血流檢測。

2.3.2 檢測方法 大鼠麻醉后俯臥位固定于腦立體定位儀上，剃去頭部毛發，消毒后從頭部正中剪開頭皮及筋膜暴露顱骨，黑色記號筆在距前囟2 mm、中線左側旁開2 mm處作一長軸約12 mm、短軸約6 mm的橢圓形，沿此橢圓邊緣打磨顱骨，磨薄至硬腦膜外，用眼科鑷在最薄處將該區域掀開，暴露骨窗作為血流檢測部位，波長為671 nm的激光照射骨窗上，相機芯片上形成血管的動態散斑圖(成像面積直徑5 mm，曝光時間10 ms，幀頻20 Hz，圖像分辨率1024×1280)，采用matlab程序計算區域1/K2值的均值作為血流速度。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 各組大鼠腦血流變化

圖1示，激光散斑對比成像偽彩色血流圖顯示，假手術組大鼠在各個時間點觀測區血流量豐富，血流速度穩定(圖中顏色越深紅代表血流速度越快)；而大腦中動脈栓塞1 d后，模型組和中藥組大鼠觀測區血流速度下降明顯；3 d和7 d時模型組大鼠腦血流未見明顯恢復，而中藥組在3 d時即見明顯血流增加，7 d時血流偽彩圖顏色加深，表明血流速度明顯加快。

圖1 各組大鼠偽彩色血流圖

3.2 化痰通絡法復方對MCAO模型大鼠相對腦血流影響

表1示，與假手術組比較，模型組1 d時腦血流速度明顯降低，差異有統計學意義(P=0.000<0.05)；在3 d時，模型組腦血流速度繼續降低，7 d時略有增加；中藥組腦血流在1 d亦明顯降低，但在3 d時即明顯增高，血流速度明顯高于模型組(P=0.000<0.05)，且高于假手術組(P=0.000<0.05)；7 d時中藥組腦血流速度繼續升高，明顯高于模型組(P=0.000<0.05)和假手術組(P=0.000<0.05)。

表1 各組大鼠不同時間點相對腦血流速度平均值

注：與假手術組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

4 討論

急性腦梗死發生后腦血流的改變是其特征性改變，也是引起腦梗死后腦損害的直接原因。重建和恢復半暗帶血運，提高腦梗死后中斷的血流供應，是治療腦梗死的重要措施。大量臨床研究證實，中醫藥療法可有效改善急性腦梗死患者神經功能缺損癥狀[10-12]，實驗研究也在揭示中醫藥療法的作用機制[13-14]。研究表明，中醫藥療法促進腦梗死患者恢復可能與改善腦血流有關。如臨床研究發現，黃芪桂枝五物湯[15]、補陽還五湯[16]、逐瘀通絡湯[17]等皆可有效改善腦梗死患者腦血流狀況。而實驗研究顯示，梓葛凍干粉[18]、丹紅注射液等可以明顯改善急性腦梗死大鼠的腦血流。

對大腦血流的檢測，不僅可以通過觀察局部腦血流的速度加深對腦梗死病理過程的認識，還可以對腦梗死的治療效果進行直觀評價。目前臨床中常用的腦血流檢測方法有腦電圖[19]、正電子發射斷層成像[20]和功能性核磁共振成像[21]等，但是這些方法存在著空間分辨率和時間分辨率較低的缺點，且設備昂貴不適宜于基礎研究。近年來，激光散斑對比度成像技術(laser speckle contrast analysis，LASCA)逐漸成為一種新興的全景快速成像方法，在臨床醫學研究方面應用比較廣泛[22-23]。它利用相干光照射在血管上，不僅可快速獲得腦組織高時空分辨率的血管分布二維圖像，同時也可定性顯示血管內血液流動速度的變化[24-25]，已被越來越多地用來檢測腦梗死后血流變化[9, 24]。

本研究中課題組采用激光散斑對比成像系統觀察化痰通絡法復方對大鼠腦梗死后腦血流的影響。研究結果發現，在大腦中動脈栓塞1 d后，模型組和中藥組大鼠腦血流速度均下降至假手術組1/2左右，從腦血流變化情況說明造模成功。模型組大鼠腦血流速度在3 d時持續下降，7 d時腦血流速度與3 d時基本一致，均低于造模后1 d時，表明在未進行干預情況下，大鼠半暗帶已經下降的腦血流未能得到及時、有效的恢復，符合腦梗死后缺血中心區和缺血半暗帶動態變化的病理過程；而中藥組大鼠在化痰通絡法復方干預3 d后，腦血流不僅恢復甚至略高于正常水平，7 d時腦血流速度為正常水平的159%，表明化痰通絡法復方可有效恢復并提高腦梗死后大腦血流速度。推測化痰通絡法復方在治療7 d時腦血流速度提升如此之高的原因與代償供應、改善微循環和為滿足腦梗死后腦血流供應有關。