影響動物布氏桿菌病試管凝集試驗的因素分析

章天霞

摘要? ? 本文分析了動物布氏桿菌病試管凝集試驗中的影響因素，具體包括血清樣品的送檢要求、稀釋液的正確配制、試劑的正確保存與使用、試管準備、樣品和稀釋比例的確定、結果判定等方面內容，并闡述了注意事項，以期為布氏桿菌病的防治提供參考。

關鍵詞? ? 布氏桿菌病;試管凝集反應;影響因素

中圖分類號? ? S855.12;R516.7? ? ? ? 文獻標識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2020）08-0230-01? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

Abstract? ? This article analyzed the influencing factors in experiment for test tube agglutination of brucellosis in animals，including the requirem-ents for the submission of serum samples，the correct preparation of dilutions，the correct storage and use of reagents，the preparation of test tubes，the determination of sample and dilution ratios，results judgment，and other aspects.The precautions were elaborated，in order to provide references for the prevention and treatment of brucellosis in animals.

Key words? ? brucellosis;test tube agglutination reaction;influencing factor

試管凝集反應（SAT）是診斷動物布氏桿菌病的常規方法之一，由于其操作簡便，具有較高的特異性和敏感性，能夠在很大程度上檢出病畜，因而是基層獸醫實驗室常用的一種檢測方法。但在實踐中由于各種因素的影響，會導致結果不準確、有偏差。現根據本人多年在基層獸醫實驗室的工作經驗，進行剖析，以供參考。

1? ? 試管凝集試驗反應原理

顆粒性抗原（完整的病原微生物或紅細胞等）與相應抗體結合，在有電解質存在的條件下，經過一定時間，出現肉眼可見的凝集小塊。

2? ? 影響因素及處理措施

2.1? ? 被檢血清

一是被檢血清必須新鮮，無明顯蛋白質凝集物，無溶血，無腐敗[1]。二是防止血清凍結和受熱，影響凝集效價。若3 d內不能送到實驗室，應冷藏保存，或按9份血清加入1份1.5%石碳酸生理鹽水的比例進行防腐。

2.2? ? 稀釋液的正確配制

石碳酸用60 ℃水浴加熱至熔化，用量程為1 mL的移液器小心吸取0.5 mL加入到99.5 mL的生理鹽水中，溶解定容至100 mL。將配制的溶液放置于高壓滅菌器內，于121 ℃、103.4 kPa、30 min條件下高壓滅菌。

2.3? ? 試劑的正確保存與使用

所有試驗試劑均需保存在2～8 ℃冰箱內;試驗前觀察試劑是否在有效期內;觀察試劑瓶口是否完好無損;同時在試驗前將凝集抗原恢復至室溫。

標準陰陽血清均為凍干品，需按要求加入規定量的稀釋液充分溶解混勻備用。以實驗室購入哈藥集團的為例，陽性血清需要加入1 mL稀釋液，陰性血清需要加入2 mL稀釋液。

抗原使用前要充分搖勻或使用大量程移液器充分吹吸混勻。試驗前依照說明書粗略計算所需的1∶20抗原用量，然后將抗原用0.5%石碳酸生理鹽水作20倍稀釋[2]。

2.4? ? 試管準備

將臟試管放入加有洗滌劑的溫水中浸泡30 min，用試管刷刷洗干凈，再用自來水沖洗，最后用去離子水沖淋。瀝干水分，放于干燥箱內，在160 ℃條件下干燥3 h。

2.5? ? 樣品和稀釋比例的確定

試驗前先要了解樣品的種類，然后再采用不同的稀釋比例。豬、羊的稀釋方法相同，牛、馬、駱駝的稀釋遞度相同。加入0.5 mL 20倍稀釋抗原后，最終羊、豬的血清稀釋遞度為1∶25、1∶50、1∶100、1∶200，而牛、馬、駱駝的稀釋遞度為1∶50、1∶100、1∶200、1∶400[3]。

2.6? ? 比濁管的正確配制

每次試驗都需配制比濁管，作為凝集反應程度的判定依據。具體如表1所示。

2.7? ? 結果判定

2.7.1? ? 對照組情況分析。每次試驗均需設立陰陽對照及抗原對照，判定結果的第一步就是判斷陰陽對照組是否成立，抗原是否發生自凝現象。

2.7.2? ? ?定性分析。如表1所示，將每份樣品的第2管與比濁管的第3管相比較，如果較比濁管第3管上層液清亮則為陽性;反之，則為陰性。

2.7.3? ? 粗略定量分析。如表1所示，將每個樣品的4個稀釋度分別與比濁管第3管比較。以豬、羊為例，若樣品第4管較比濁管第3管清亮，則凝集效價記為：>200;若樣品第4管與比濁管第3管差不多，凝集效價記為：200;若樣品第4管較比濁管第3管混濁，而第3管較比濁管第3管清亮（或差不多），則凝集效價記為：100;若樣品第3管較比濁管第3管混濁，而第2管較比濁管第3管清亮（或差不多），則凝集效價記為：50;若樣品第2管較比濁管第3管混濁，而第1管較比濁管第3管清亮（或差不多），則凝集效價記為：25;若樣品第1管較比濁管第3管混濁，則記為：<25。

3? ? 注意事項

一是移液器的正確使用。移液器的最佳量程范圍是最大量程的35%～100%。一般情況下，移液器具有2個檔位，第1檔為正確量程;第2檔容量遠超預定量程，如果操作失誤會造成加樣體積過大，導致結果嚴重偏差。移液器滴頭要安裝牢固，防止漏氣，吸量液體時要將滴頭伸入液面以下適當位置，保證達到所需的移液量，同時讓吸頭外壁盡量少接觸液體。二是加樣稀釋時要充分混勻，保證稀釋遞度的準確性。1∶20 配制抗原使用之前及滴加后也要充分搖勻，使血清中的抗體與抗原反應充分[4-5]。三是嚴格按操作規程設定反應時間與溫度——37～40 ℃，24 h。四是試驗完成后，將試管封膜放入培養箱，確保試管中反應體系穩定。五是在加樣過程中可能會出現漏加樣或誤加樣。六是判定樣品凝集效價時，人為因素影響比較大，可以同時參考虎紅平板凝集試驗結果[6-8]。

4? ? 參考文獻

[1] 國家質量監督檢驗檢疫總局.動物布魯氏菌病診斷技術：GB/T18646-2002[S].北京：中國標準出版社，2002.

[2] 中國合格評定國家認可委員會.CNAS-CL01《檢測和校準實驗室能力認可準則》應用要求：CNAS-CL52：2014[S].北京：中國標準出版社，2014.

[3] 中國合格評定國家認可委員會.檢測和校準實驗室能力認可準則：CNAS-CL01：2006[S].北京：中國標準出版社，2006.

[4] 賈澤穎，劉鄧，郭安娜，等.布魯氏菌病多種檢測方法的比較[C]//首屆中國奶業大會論文集（上冊）.北京：中國奶業協會，2010.

[5] 鄭源強，吳巖，畢力夫.布魯氏菌病檢測、防控措施與疫苗研究進展[C]//2011新型疫苗與抗體創制關鍵技術及質量控制研討會論文集.北京：全國醫藥技術市場協會，2011.

[6] 師志海，王文佳，蘭亞莉.布氏桿菌檢測方法的研究進展[J].黑龍江畜牧獸醫，2011（15）：44-46.

[7] 劉磊，劉晶芝，趙寶華.布氏桿菌病的檢測與防治[J].安徽農業科學，2007（20）：6139-6141.

[8] 廖雅麗，張哲林，任彩云，等.布氏桿菌病研究進展[J].內蒙古醫科大學學報，2015，37（增刊1）：73-77.