老年性癡呆患者載脂蛋白E基因多態性與淀粉樣β蛋白前體16-17外顯子表達的相關性及意義

劉 博 孟凡超

鄭州市第二人民醫院，河南 鄭州 450000

老年癡呆癥又稱阿爾茨海默病，是發生在老年期及老年前期的一種原發性退行性腦病，是一種持續性高級神經功能活動障礙，臨床癥狀主要表現為記憶力、思維能力、分析判斷能力、視空間辨認能力、生活自理能力及情緒控制等方面的障礙。隨著社會老齡化進展，AD在全球的發病率持續上升，目前是社會研究的熱點，AD的病因及其發病機制仍不明確。一般認為老年癡呆癥特征性病理變化為大腦皮質萎縮，腦內大量β樣淀粉酶蛋白(Aβ)積聚形成的老年斑和tau蛋白過度磷酸化形成的神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFT)是AD主要的病理特征。載脂蛋白 E是一種主要的膽固醇載體，在維持周圍和大腦的脂質平衡方面起重要作用，ApoE主要由星形膠質細胞產生，并通過低密度脂蛋白受體(LDLR) 的成員傳遞膽固醇和其他必需的脂質，參與脂質的代謝與轉運。ApoE不僅與動脈粥樣硬化密切相關，且有助于神經元的修復及大腦葡萄糖的代謝，并參與神經元的分化和遷移。此外與各種病因導致老年化的認知功能受損相關，使人類智能受到嚴重影響。AD是由多種原因共同影響導致的，存在多源性，1、14、19及21號染色體或其他因子突變導致AD[1-3]。近年來，研究發現不同ApoE的異構體對β-App的水解作用有所差異，ApoE4表達相比ApoE3更易形成顯著β-APP沉淀[4-8]。本文應用PCR-RFLP技術和RT-PCR技術測定AD患者和健康老年人的ApoE基因多態性與β-APP16-17表達相關性。

1 資料與方法

1．1一般資料以鄭州市第二人民醫院2018-02-2019-08診治的32例AD患者為研究組，均經癥狀、認知測評、顱腦CT或MRI等檢查確診，符合《中國癡呆與認知障礙診治指南》相關診斷標準[9-14]。臨床表現為記憶力減退、語言能力退化、行為障礙等。納入標準：(1)確診為AD，且為首次診治；(2)年齡60～80歲；(3)對研究知情并配合。排除心肝腎功能不全、繼發性癡呆、顱腦創傷及顱腦惡性腫瘤等患者。男18例，女14例；年齡62～75(68.5±3.4)歲；病程1～5(3.2±0.8)a；文化水平：初中及以下22例，高中6例，大專及以上4例。選取同期到鄭州市第二人民醫院健康體檢的32例健康老年自愿者為正常組，均無心腦血管病變、惡性腫瘤、顱腦創傷扥病癥，對研究知情并同意。男20例，女12例；年齡59～75(64.3±3.6)歲；文化水平：初中及以下17例，高中11例，大專及以上4例。2組基線資料無顯著性差異(P>0.05)，具有可比性。

1．2方法

1．2．1 檢測準備：2組受檢者均抽取晨起空腹外周靜脈血5.0 mL，進行常規抗凝處理后，再進行DNA、RNA提取，應用紫外線分光光度計測量260 nm、280 nm波長部位的吸光度值，兩者比須高于2。

1．2．2 ApoE基因檢測：開展PCR-RFLP檢測，選取ApoE基因第4外顯子含有編碼為第112位、158位氨基酸一段基因序列對其基因多態性進行分析，以F4(5’-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3’)和F6(5’-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3’)作為擴增引物。擴增產物長為244bp，通限制性內切酶處理完成后，根據酶切電泳圖譜分型。

1．2．3 β-APP16-17檢測：檢測材料：①RNA反轉錄cDNA，20 μL反應液含4 μL總RNA，隨機引物量為(0.5 g/L)1 μL，RNA sin Inhibitor為0.5 μL，dNTPs、10×Buffer各2 μL，MgCl2為4 μL，AMV反轉錄酶為1 μL及一定量DEP處理水。42 ℃ 90 min，52 ℃ 30 min，保存在-20 ℃環境下。②β-APP16-17表達引物，取β-APP基因16、17外顯子含編碼β-APP一段基因序列合成β-APP，以APP9(5’-GACAAATATCAAGACGGAGGAG-3’)、APP10(5’-CCACACCATGATGAATGGATGTG-3’)作為擴增引物，擴增產物長為233 bp。③參照模板引物，選用和VD、AD不相關且在血細胞表達的人紅細胞β血影蛋白基作為參照模板。并擴增β血影蛋白基因一對引物的5’端分別與上上述引物App9、App10序列相接，引物包括BS1-App9(5’-G ACAAATATCAAGACGGAGGAGGTGGCTGAGGCGTGGCT-GATTGC-3’)、BS3-App10(5’-CCACACCATGATGAATGGATGTGTCTCAAAAGCCTCATGCCTC-3’)，通過常規PCR處理后，合成長154 bp片段，應用純化DNA測定濃度。再稀釋成100 μmol/L溶液置于-20 ℃冰箱保存。

1．2．4 檢測操作：①競爭RT-PCR檢測，每一份樣本同時行4管PCR，每管內加等量1 μg cβ-APP與不等量gApp(10、5、1與0.5 amol)，引物主要是App9、App10，dNTPs 200 μmol/L及Taq酶與適量水，雖然反應體積是50 μL。PCR循環參數93 ℃為 30 s，60 ℃為 60 s，74 ℃ 為90 s，一共40個周期，再行74 ℃延伸。每份樣本4管PCR產物于同塊含EB1.5 g/L瓊脂糖凝膠上點樣電泳，100 V電泳1 h。每個樣本管PCR可作為兩條DNA擴增帶，gβ-APP、cβ-APP模板產物長分別是154 bp、233 bp。②β-APP16-17檢測，把每份樣本電泳圖輸入VIDAS圖像處理系統，然后對2條DNA帶進行吸光度掃描，以得到吸光度值；然后再算得log cApp16-17/gApp16-17。將4個amol濃度的gβ-APP16-17值作為X軸，相應的cApp16-17/gApp16-17吸光度比值的log值作為Y軸，開展直線回歸分析，以得到cApp16-17/gβ-APP16-17作為1時，其相應gβ-APP16-17 amol值即該樣本測定的cβ-APP16-17表達水平[15-19]。

2 結果

2．1 2組ApoE基因型頻率及等位對比2組均以ε3/ε3型為主，研究組患者的ε3/ε3型顯著低于正常組(P<0.05)，ε3/ε4、ε4/ε4基因型頻率增高。見表1。同時，研究組ε3等位基因頻率低于正常組(P<0.05)，ε4等位基因頻率高于正常組(P<0.05)。見表2。

表1 2組ApoE基因型頻率比較 [n(%)]

表2 2組ApoE等位基因型頻率比較 [n(%)]

2．2 2組β-APP16-17表達對比通過競爭檢測，研究組患者的β-APP16-17表達水平為(3.61±0.88)pmol/g，正常組為(2.28±0.51)pmol/g，有顯著性差異(t=10.253，P<0.05)。

2．3 2組不同ApoE等位基因的β-APP16-17表達對比根據ApoE等位基因分成ε2、ε3、ε4等位基因攜帶者，通過測定，2組不同等位基因攜帶者的β-APP16-17表達存在差異，但無統計學意義(P>0.05)。見表3。

2．4 2組ApoE有無ε4等位基因的β-APP16-17表達對比2組ApoE有ε4與無ε4等位基因的β-APP16-17表達差異無統計學意義(P>0.5)。見表4。

表3 2組ApoE等位基因的β-APP16-17表達水平比較

表4 2組有無ApoE等位基因的β-APP16-17表達水平比較

3 討論

3．1 ApoE基因ApoE是人體一個重要載脂蛋白，其基因在人類第19號染色體上。在編碼區第4個外顯子單個堿基的替換，也就是T-C互換構成ε2、ε3及ε4等三個遺傳性、共顯性等位基因，這三者中任何兩個表達均可形成6種表型，即3種純合子與3種雜合子，其中，ε4是臨床研究最先被確定是AD易感易發基因[20-22]。

3．2 β-APP基因β-APP基因是位于人類第21號染色體上一個基因，由其第16、17外顯子編碼水解片段β-APP16-17，研究證實是AD患者老年斑一個主要的蛋白成分[23-24]。在β-APP正常水解代謝單單產生少量的Aβ，但在病理狀態下，倘若某個因素，譬如：神經元變性，就會促進β-APP表達上調，進而改變其代謝，致Aβ水平顯著增高。β-APP基因的100～207區間有著ApoE結合位點，ApoE 2、3、4均能夠與β-APP的分子相結合。研究發現[25-26]，把ApoE和App751共表達于COS1細胞，會對COS1細胞的β-APP代謝分泌造成影響，造成細胞分泌型β-APP減少。

3．3 ApoE、β-APP與AD相關性臨床上對AD患者的腦脊液進行成分分析，結果證實ApoE為淀粉類基因蛋白質病理性結合因素。且ε4等位基因頻率在正常人群為0.15，在AD患者為0.50。神經病理學研究表明，Aβ與ApoE穩定結合，且AD個體會表現出對ApoE4的劑量依賴性增強。此外，在人的腦脊液、血漿以及腦組織勻漿中，均發現ApoE與某些可溶性Aβ會有部分聯結。研究表明[27-28]，ApoE在Aβ形成中發揮著動力學抑制因子效用，具體而言，就是通過作用于Aβ的“成核”與纖維形成，進而對β-APP的β折疊產生影響，進一步對Aβ沉積造成影響。同時，ApoE還能夠通過ApoE受體清除神經纖維內的Aβ。還可通過Aβ自腦細胞外進到系統循環運輸清除Aβ。

本研究顯示，AD患者的ε3/ε4、ε4/ε4基因型頻率顯著增高，且ApoEε4等位基因是AD發生的重要危險因子，但其對AD患者的β-APP16-17表達水平無明顯影響。與國外研究報道的β-APP表達水平增高的結果有所出入，可能是本研究的樣本量少，定量精確度不夠造成的[29-30]。因而，需要進一步開展更大樣本的研究分析，并研究進行有著ApoE各等位基因與β-APP基因突變AD患者的β-APP16-17表達水平檢測，以便系統、全面地明確β-APP16-17過分表達的內在原因，進而為AD的診治提供新的方向和方法指導。