研究長鏈非編碼RNA HOTAIR在結直腸癌中的表達、臨床意義和預后效果

劉振興，高 翔，張 震，魏建昌*

（武安市中醫院，河北 邯鄲 056300）

結直腸癌是當今世界上發病率較高的惡性腫瘤之一，每年約有140萬新增病例，平均每年約有60萬患者由于結直腸癌死亡[1]，及時地診斷發現并進行有效的治療能夠幫助降低患者的死亡幾率，但很大一部分患者在確診時已經是癌癥的進展期，局部的侵襲和遠處的轉移造成了患者的死亡。因此，預防和控制結直腸癌的進展、轉移對改善患者的預后有重大的意義。本文通過分析HOTAIR的表達情況與結直腸癌病情的聯系，尋找該基因對結直腸癌早期診斷的意義。

1 資料與方法

1.1 選取對象

選取本院2017年1月至2018年2月期間確診患者的結直腸癌組織和癌旁正常組織標本，每組90例，同時密切記錄患者的完整資料。

1.2 實驗試劑與儀器

實驗試劑為Takara公司的RNA逆轉錄試劑，美國伯樂公司的SYBR Gree實時定量試劑盒，生工生物（北京）有限公司設計合成的HOTAIR和GAPDH引物，實驗儀器為瑞士羅氏公司的全自動電化學發光免疫分析儀。

1.2.1 RT-PCR法監測HOTAIR mRNA的表達

提取總RNA并定量，反轉錄為cDNA。linc RNA HOTAIR引物，上游5'CACTGGGGAACTCTGACTCC-3'，下游5'-GTGCCTGGTGCTCTCTTACC-3'；GAPDH引物，上游5'-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3'，下游5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'。

PCR反應試劑：SYBR Premix Ex Taq（Tli RNas-eH Plus），TaKaRa Code：DRR420A去1μL的2×PrimeSTAR Max Premix，0.4μL的sense primer，0.4μL的anti-sense primer，加滅菌蒸餾水至20μL，混合后離心。PCR反應體系，95攝氏度下孵育30秒，95攝氏度下孵育5秒，60攝氏度下孵育20秒，一共進行四十次循環反應；然后72攝氏度下孵育20秒，95攝氏度下孵育15秒后停止。使用熒光定量PCR方式處理試驗數據，中位數以上的為高表達，中位數以下的為低表達。

1.2.2 隨訪

隨訪以電話回訪或復查方式進行，回訪時間為2019年6月20日。

1.3 統計學處理

使用SPSS17.0統計學軟件對數據進行分析，數據用“均數±標準差”來表示，兩組數據的比較使用t值進行檢驗，計數資料使用百分率進行表示，兩組的比較使用x2進行驗證，多組的比較需要使用方差進行分析，使用GraphPad Prism 6繪制統計圖，用Kaplan-Meier法進行生存曲線的繪制，制作Cox回歸模型分析影響結直腸癌患者的原因，當P＜0.05時，差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 HOTAIR MRNA的表達

以HOTAIR與GAPDH的比值作為RT-PCR的定量分析，研究組中的表達水平為（0.86±0.05），對照組中的表達水平為（0.17±0.02），計算可知，P=0.03，差異具有統計學意義。

2.2 HOTAIR的表達與臨床表現的關系

對比研究組與對照組，HOTAIR的表達與細胞浸潤、腫瘤分期、淋巴結以及肝轉移、脈管浸潤等都有緊密關聯，計算結果均為P＜0.05。該基因的表達程度越高，腫瘤分期越高、分化越低；在出現淋巴結轉移、肝轉移以及神經浸潤癥狀的患者中，HOTAIR的表達程度明顯高于未出現癥狀的患者；但該基因的表達與患者腫瘤的體積形態、病變類型和部位并沒有明顯聯系。詳見表1。

2.3 HOTAIR的表達水平與患者存活率的關系

根據回訪結果進行分析，截止到回訪日，一共有48位患者死亡，存活率為46.66%，死亡患者體內的HOTAIR表達水平為（0.885±0.100），生存患者體內的表達水平則為（0.660±0.115），P=0.002，差異具有統計學意義。該基因表達水平較高的患者共有58位，其中20位存活，38位死亡，生存時間的中位數為16個月，而在表達水平較低的32位患者中，10位死亡，22位生存，生存時間的中位數為21個月。使用Kaplan-Meier生存曲線進行Log-rank單變量的分析，結果顯示，HOTAIR的表達水平影響著患者的生存時間，其結果x2=7.059，P=0.011，具有統計學意義，也就是說，HOTAIR表達水平越高的患者，生存時間越短，預后越差。詳見表1。

2.4 Cox回歸模型

HOTAIR表達水平（95%CI：1.306～2.913，P=0.001）、淋巴結轉移（95%CI：1.039～1.622，P＜0.001）、分化程度（95%CI：1.719～2.369，P=0.035）等都是結直腸癌的預后影響因素。見表1。

表1 結直腸癌組織中lineRNA HOTAIR mRNA的表達及與臨床相關病例參數的關系[n(%)]

3 討 論

在之前有關于HOTAIR表達水平與疾病變化的臨床研究中，美國斯坦福大學RINN[2]等學者研究證實，HOTAIR的表達主要是通過結合一系列的蛋白復合體進而調控下游的相應蛋白進行表達。CUPTA[3]等曾在研究中發現，HOTAIR在乳腺癌的病變部位以及轉移部位組織細胞中表達水平是正常細胞中的200～2000倍，證實HOTAIR對乳腺癌的早期診斷以及病情監測有重要作用。KATATAMA等[4]則在研究中證實，HOTAIR對腎細胞癌的監測作用，LOEWEN等則在研究中證實HOTAIR的表達水平對肺癌的發展和預后有著密切聯系。截至目前，國內少有相關文獻指出該基因與結直腸癌病情的具體關系。

本研究從基因層面進行研究，證實HOTAIR在結直腸癌患者病變的細胞中的表達水平明顯高于正常的腸黏膜細胞，并且，其表達水平與疾病的發展與變化密切相關，當HOTAIR的表達出現異常時，會打破人體內致癌與抑癌基因的平衡，導致腫瘤細胞的活性增加，加速腫瘤細胞在人體內的擴散和轉移。

在后期的回訪中，進一步證實，HOTAIR表達水平較高的患者，死亡率也相對增加，生存時間也明顯低于表達水平較低的患者，因此，HOTAIR的表達水平可以作為臨床應用中監測患者預后情況的重要指標。除此之外，Cox回歸模型也能證明該基因的表達水平是直腸癌患者預后評測的一個獨立因素。

綜上所述，結直腸癌的病發和病變過程中伴隨著HOTAIR的表達變化，深化研究基因表達與疾病機制以及臨床治療影響的聯系，能夠為當代結直腸癌病癥的研究提供重要的參考價值，對于該方向的深入研究，將是以后值得重點關注的方向。