在乳腺癌細(xì)胞中構(gòu)建CRISPR多基因編輯系統(tǒng)

梅義， 王真， 戴曉峰

(1. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院， 無(wú)錫 214122； 2. 江南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 無(wú)錫 214122)

CRISPR技術(shù)作為一種常見(jiàn)的基因編輯手段被使用于在各個(gè)領(lǐng)域中，其中對(duì)于沒(méi)有剪切活性的CRISPR-dCas9編輯系統(tǒng)的應(yīng)用同樣越來(lái)越廣泛[1-5]。例如在微生物中，有團(tuán)隊(duì)利用CRISPR-dCas9基因編輯系統(tǒng)在鏈霉菌中實(shí)現(xiàn)了多基因的抑制[4]；在植物中，基于CRISPR-dCas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了多重轉(zhuǎn)錄激活或者抑制效果[6]。但是在乳腺癌研究中，關(guān)于CRISPR-dCas9多基因編輯系統(tǒng)的應(yīng)用卻鮮有報(bào)道。乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的腫瘤疾病之一，也是全球女性中發(fā)病率最高的腫瘤疾病[7-8]，如果在乳腺癌研究中構(gòu)建一套簡(jiǎn)單、高效、精確、可靠的基因編輯技術(shù)，將有利于腫瘤基礎(chǔ)研究。

2006年，Takahashi等[9]首次發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子OCT4、KLF4、MYC和SOX2，可以將已經(jīng)分化的細(xì)胞重新編程，使已分化的細(xì)胞回歸到胚胎細(xì)胞狀態(tài)，得到了具有重新分化潛力與自我更新能力的多能干細(xì)胞，這4個(gè)基因誘導(dǎo)形成的多能干細(xì)胞也成了科研人員所常用的細(xì)胞模型[10-11]。在本研究中，作者通過(guò)將tRNA與sgRNA串聯(lián)組合，構(gòu)建了一套CRISPR-dCas9多基因編輯系統(tǒng)，并在MCF7、SUM149PT細(xì)胞系中對(duì)OCT4、KLF4、MYC和SOX2 4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)一步在基因表達(dá)、蛋白表達(dá)以及功能改變3個(gè)層次進(jìn)行檢測(cè)，以此驗(yàn)證系統(tǒng)的穩(wěn)定與可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞系MCF7、SUM149PT來(lái)源于美國(guó)模式菌種收集中心(American Type Tissue Culture Collection，ATCC)；DMEM、F12培養(yǎng)基購(gòu)于HyClone公司，胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)購(gòu)于Lonsera公司；CRISPR相關(guān)編輯質(zhì)粒購(gòu)于愛(ài)必夢(mèng)生物科技有限公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)于東仁化學(xué)公司；ALDEFLUORTM試劑盒購(gòu)于STEMCELL Technologies公司；超純RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于Takara公司；……