逆針灸對過敏性哮喘大鼠血清IL-2含量及肺組織GATA-3蛋白表達的影響*

華金雙，邵素菊，王培育，張 君，何竹青，鄭 潔，田 麗，徐 寧，胡曉京，楊京京

(河南中醫藥大學針灸推拿學院，河南 鄭州 450046)

逆針灸是指在無病或者疾病即將發生之時，運用針刺或者艾灸的方法來提高機體的免疫力，從而防止疾病的發生，達到治未病作用的一種方法。課題組的前期研究表明[1-2]，逆針灸可以啟動機體內源性的保護機制，抵抗隨后可能發生的疾病損害。支氣管哮喘是一種以氣道炎癥、氣道高反應性、可逆性氣道阻塞和氣道重塑為主要特征的慢性氣道疾病[3],針灸在減輕氣道炎癥及降低氣道高反應性方面具有較好的效果[4-5]，但是在哮喘欲發而未發階段，給予逆針灸干預是否能減輕哮喘急性發作還知之甚少。本研究通過觀察逆針灸對過敏性哮喘大鼠血清白介素-2(IL-2)含量和肺組織中轉錄因子GATA結合蛋白3抗體(GATA-3)蛋白表達的影響，探討逆針灸對過敏性哮喘大鼠的預保護機制。

1 材料與方法

1.1 動 物

健康雄性SPF級SD大鼠40只，體質量160～180 g，由河南省實驗動物中心提供，動物合格證號為SCXK(豫)2017-0001，動物使用許可證號為SYXK(豫)2015-0005。實驗過程中對動物的處置嚴格遵守中國科學技術部2006年發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。動物自由飲水和攝食，定期更換墊料。室溫為20～22 ℃，濕度60%～70%，通風良好。剔除疾病、意外死亡等不符合實驗要求者。

1.2 試劑與儀器

卵蛋白(OVA)，北京索萊寶科技有限公司產品，批號20180521；氫氧化鋁干粉,上海麥克林生化科技有限公司產品，批號20180411；質量分數9 g/L氯化鈉注射液，河南科倫藥業有限公司產品，批號A18020101-2；GATA-3一抗，武漢博士德生物工程有限公司產品，批號BA0885；無菌針灸針，直徑0.25 mm、長度13 mm，北京中研太和醫療器械有限公司產品, 批號212160613；細艾條，南陽漢醫艾絨有限責任公司產品，批號2016-11-20。晶體管超聲霧化器，鞍山市無限電一廠產品；RM2015型切片機，德國Leica公司產品；BX43型光學顯微鏡，日本Olympus公司產品。

1.3 動物分組與模型的建立

在水和標準飼料充足條件下飼養大鼠1周，按隨機數字表法分為正常對照組、模型對照組、逆針組和逆灸組。

除正常對照組外，其余各組動物均以新鮮配制的質量分數為100 g/L的復合OVA抗原溶液(每升抗原液中含有OVA 100 g，氫氧化鋁干粉100 g)1 mL進行腹腔注射致敏。在實驗的第1天和第8天各注射1次使大鼠致敏。第15天，將大鼠置于密閉的霧化箱內，由壓縮霧化器噴入質量分數為10 g/L的卵蛋白溶液20 min激發哮喘，每天1次，連續7 d。7 d后，以如下標準判別模型是否成功：霧化初期大鼠表現為煩躁不安，抓耳撓腮，呼吸急促，活動頻繁；后期大鼠出現俯伏不動，毛發無光澤，反應遲鈍、精神萎靡不振。

1.4 各組大鼠的處理方法

逆針組：造模的同時，在致敏階段給予隔天1次的針刺干預，連續2周；激發階段給予每天1次的針刺干預，連續1周。取穴：肺俞(雙)、大椎、風門(雙)、足三里。采用直徑0.25 mm、長度13 mm針灸針，大椎直刺5 mm，風門、肺俞直刺6 mm，足三里直刺7 mm。每次20 min，每隔10 min行針1次,平補平瀉法。若適逢給予大鼠致敏或激發，則先針刺后致敏或激發。

逆灸組：造模的同時，在致敏階段給予隔天1次的溫和灸干預，連續2周；激發階段給予每天1次的艾灸干預，連續1周。取穴：肺俞(雙)、大椎、風門(雙)、足三里。持細艾條行溫和灸法，艾條距離上述穴位2～3 cm，每次灸20 min。若適逢給予大鼠致敏或激發，則先艾灸后致敏或激發。

正常對照組用生理鹽水代替卵蛋白。正常對照組和模型對照組每天給予同樣的抓握刺激，不做任何治療。

1.5 檢測指標

1.5.1 標本取材

最后1次治療結束后24 h內用質量分數100 g/L的水合氯醛3.5 μL/g腹腔注射麻醉大鼠，脫頸椎處死大鼠，迅速打開胸腹腔，暴露出腹主動脈，用10 mL注射器抽取血液3～5 mL，置于普通試管，靜置30 min，以3 000 r/min離心10 min，取上清，-20 ℃保存。取右肺中下葉，用4 ℃質量分數為9 g/L的氯化鈉注射液漂洗干凈，立即放入新鮮配制的質量分數為40 g/L的多聚甲醛溶液中固定24 h以上，用石蠟包埋，切片，待用于肺組織免疫組化檢測。

1.5.2 肺組織形態學改變

肺組織常規石蠟包埋，二甲苯脫蠟，經各級乙醇至水洗，蘇木素-伊紅(HE)染色，常規脫水，透明，封片。顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織形態學改變。

1.5.3 IL-2含量

采用酶聯免疫吸附法測定大鼠血清IL-2含量，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5.4 肺組織GATA-3蛋白表達

采用免疫組織化學法檢測。石蠟組織切片，切片用二甲苯脫蠟3次，各10 min，依次在無水乙醇、體積分數950 mL/L乙醇、800 mL/L乙醇、750 mL/L乙醇中浸泡，蒸餾水脫蠟至水化。將切片放入檸檬酸鹽修復液中，高壓修復2 min，在室溫條件下自然冷卻，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min。滴加30 g/L 雙氧水(即內源性過氧化物酶阻斷劑)，室溫孵育20 min，PBS沖洗3次，每次5 min。滴加一抗，4 ℃過夜，PBS洗3次，每次5 min。滴加二抗，37 ℃避光20 min，放入PBS中洗3次，每次5 min。配制DAB顯色液，滴加到切片上，蘇木素復染，常規脫水、透明，中性樹膠封片。顯微鏡觀察，測定陽性免疫染色強度及面積，結果采用平均光密度(MOD)表示。

1.6 統計學方法

2 結 果

2.1 各組大鼠肺組織形態學改變

正常對照組大鼠肺部未見明顯異常，肺泡及支氣管形態結構基本正常，氣道及周圍血管有少量炎性細胞浸潤。模型對照組大鼠氣管及小血管周圍可見大量的炎性細胞浸潤；支氣管管腔狹窄，管壁增厚；氣道黏膜下組織水腫明顯。逆針組和逆灸組均可見氣管及其周圍炎性細胞浸潤，管腔狹窄，氣道黏膜水腫，但與模型對照組對比炎性細胞浸潤程度明顯降低，管腔狹窄及水腫明顯好轉。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織形態學檢查(HE染色，×400)

2.2 各組大鼠血清IL-2含量對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠血清IL-2含量升高，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型對照組對比，逆針組和逆灸組IL-2含量降低，差異有統計學意義(P<0.01)。逆針組和逆灸組之間IL-2含量對比，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

組 別nIL-2/(ng·L-1)正常對照組10315.00±59.86模型對照組10719.80±73.27??逆針組10559.40±60.12??##逆灸組10618.80±67.61??##

注：與正常對照組對比，**P<0.01；與模型對照組對比，##P<0.01。

2.3 各組大鼠肺組織GATA-3蛋白表達對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠GATA-3平均光密度值升高，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型對照組對比，逆針組和逆灸組GATA-3平均光密度值降低，差異有統計學意義(P值依次為P<0.05、P<0.01)。逆針組和逆灸組之間GATA-3蛋白表達對比，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

組 別nGATA-3正常對照組100.021±0.007模型對照組100.054±0.014??逆針組100.039±0.009?#逆灸組100.035±0.010?##

注：與正常對照組對比，*P<0.05；**P<0.01；與模型對照組對比，#P<0.05; ##P<0.01。

3 討 論

治未病理論是中醫學中承載著預防觀念的學術思想，其內涵與西醫學從治療疾病向預防疾病轉變的戰略思想有異曲同工之處?！端貑枴に臍庹{神大論篇》就已經提出“是故圣人不治已病治未病，不治已亂治未亂”。唐代孫思邈更是將疾病分為未病、欲病、已病3個層次，認為“上醫醫未病之病，中醫醫欲病之病，下醫醫已病之病”。在疾病發生前，采用合適的方法阻斷疾病的發生，延緩疾病的發展，減少機體的損害，對防治疾病具有重大意義。

目前針灸治療哮喘的研究內容頗豐，但多集中在哮喘發作以后的治療效果和機制方面[6-7]，關于逆針灸對哮喘的預防性保護作用資料較少，尚未檢索到詳細報道。本研究在以往逆針灸作用機制研究的基礎上，繼續探討逆針灸對過敏性哮喘大鼠的預保護作用及其機制。

哮喘屬中醫學“哮病”范疇。當機體在某些誘發因素如感冒、呼吸道細菌感染、吸入過敏原等作用下，就會成為哮喘高危人群，若不及時治療便會進入哮喘持續發作階段。當哮喘發作時，多種炎性細胞和細胞因子參與氣道炎性反應，其中Thl和Th2細胞的分化平衡狀態對哮喘的發生、發展起到重要作用。研究報道，轉錄因子T-bet和GATA-3是影響Thl與Th2細胞分化的關鍵決定因子[8]。其中GATA-3是Th2細胞分化必不可少的轉錄因子，其表達在Th2譜系分化的細胞中顯著上調[9]。GATA-3是GATA的家族成員，僅在Th2細胞中表達。GATA-3一方面通過上調IL-4、IL-5等Th2型細胞因子的表達，活化趨化因子，吸引EOS、中性粒細胞等向呼吸道的炎癥部位聚集和浸潤，從而促進哮喘氣道炎癥的發生和發展；另一方面還可通過抑制Thl特異性轉錄因子T-bet促進Th2細胞分化，對多種靶基因起到促進和抑制作用[10]。研究發現，GATA-3 基因敲除大鼠合成Th2 細胞因子的能力顯著降低，無法形成由Th2介導的氣道炎癥[11]。近年來，4q24-27染色體區域所含基因被認為與過敏性疾病密切相關[12]。IL-2基因恰位于4q27，IL-2是Thl細胞因子，可刺激T細胞MHCⅡ類抗原的表達，并產生γ-干擾素、腫瘤壞死因子-α等細胞因子從而發揮效應功能。另外，IL-2還可促進B細胞增殖和分泌抗體，產生Th2型細胞因子的效應。外周血或血漿中IL-2水平的變化會影響Thl與Th2分化平衡[13]。研究[14]報道，哮喘患者血清中IL-2的水平明顯高于正常人，且IL-2的濃度與FEV1%預計值呈負相關。

本實驗結果表明，與正常對照組對比，模型對照組大鼠血清IL-2含量明顯升高，這與上述研究結果一致，而逆針組和逆灸組血清IL-2含量明顯降低(P<0.05)。此說明逆針灸可以顯著抑制哮喘大鼠血清中促炎因子的分泌，減輕氣道炎癥。同時逆針組和逆灸組還可以顯著降低哮喘大鼠肺組織中GATA-3蛋白表達，表明逆針灸可通過降低GATA-3蛋白表達，抑制由Th2介導的氣道炎癥，從而減輕哮喘氣道炎癥的發生和發展。

逆針灸是中醫治未病的重要手段。在哮喘欲發而未發階段，通過增強機體免疫力，調動內源性保護機制是防止哮喘持續發作和減輕哮喘癥狀的有效措施。本實驗在哮喘未發階段即給予針、灸干預，結果表明, 能有效減輕哮喘大鼠的癥狀，抑制氣道炎癥反應和氣道重塑 ,其作用機制可能與下調血清IL-2含量和降低肺組織中GATA-3蛋白表達有關，提示對哮喘大鼠具有預保護作用。