抗苗勒管激素在不同年齡段女性生育功能預(yù)測(cè)中的運(yùn)用價(jià)值探討

蘭云竹 毛熙光

1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖中心，四川瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川瀘州 646000

隨著二胎政策的推廣使不少懷有“二孩”夢(mèng)想的生育期女性重燃希望，傳統(tǒng)的基礎(chǔ)內(nèi)分泌測(cè)定如血清卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、雌二醇（Estrodiol2，E2）、抑制素B（InhB）或者竇卵泡數(shù)（Antral follicle，AFC）雖然能夠滿足對(duì)生育期女性卵巢功能初步評(píng)估，由于下丘腦-垂體-卵巢 軸（hypothalamic pituitary ovaria naxis，HPO）調(diào)控及各激素之間的反饋影響，仍然不能準(zhǔn)確、快速的反應(yīng)卵巢儲(chǔ)備功能情況[1]，和提供更為全面的臨床治療方案指導(dǎo)。所以探索一種能方便、快捷，受下丘腦-垂體-卵巢軸影響小，評(píng)估卵巢功能的方法不僅有助于輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）個(gè)體化方案的選擇和制定，同時(shí)也可以對(duì)臨床結(jié)局提供預(yù)測(cè)依據(jù)。抗苗勒管激素（anti-müllerian hormone，AMH）是人體分泌的重要性腺激素，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factors β，TGF-β）超家族，主要表達(dá)于竇前卵泡（preantral follicle）及直徑＜4mm的小竇狀卵泡，通過(guò)自分泌和旁分泌途徑，調(diào)節(jié)卵泡發(fā)生發(fā)展[2-3]，隨著卵泡直徑增大AMH值逐漸減小[4]，直至閉鎖卵泡不表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)主要收集我院生育期女性資料，探討AMH在月經(jīng)規(guī)律生育期女性各個(gè)年齡段生育功能評(píng)估價(jià)值。

1 資料及方法

1.1 一般資料

選取2017年9月～2018年9月在西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院不孕不育中心就診的生育期女性。納入標(biāo)準(zhǔn)：月經(jīng)規(guī)律（月經(jīng)經(jīng)期3～7d；月經(jīng)周期25～32d，自測(cè)體溫或B超檢測(cè)有排卵）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）內(nèi)分泌疾病。多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）、甲狀腺功能亢進(jìn)或減退、糖尿病、自身免疫系統(tǒng)疾病、急慢性腎病、乳腺疾病等；（2）手術(shù)史。惡性腫瘤手術(shù)史或直接放/化療、器官移植史、卵巢手術(shù)史、宮外孕/分粘手術(shù)史、盆腹腔探查手術(shù)史等；（3）影像學(xué)排除卵巢結(jié)構(gòu)異常；（4）排除標(biāo)本量少、肝腎凝血功能不全病史。通過(guò)排除標(biāo)準(zhǔn)及納入標(biāo)準(zhǔn)，最終有2986例患者納入研究。Piltonen等[5]認(rèn)為從25歲開(kāi)始，每隔5年，為女性生殖激素變化的“分界點(diǎn)”，所以本實(shí)驗(yàn)將其分為 A組（≤25歲）634例、B組（26≤X＜30歲）835例、C組（30≤X＜35歲）615例、D組（35≤X＜40歲） 470例、E組（≥40歲）432例，所有研究均獲得患者知情同意，各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.2 方法

1.2.1 收集標(biāo)本 于上午7～10點(diǎn)抽取空腹肘靜脈血5mL，室溫放置后，利用離心機(jī)離心，選取離心力為1200g，離心時(shí)間均為10min（1200×g離心10min），由本院AMH值專(zhuān)業(yè)檢測(cè)人員進(jìn)行檢測(cè)，采用ELASA進(jìn)行檢測(cè)血清AMH值。

1.2.2 檢測(cè)原理及方法 血清AMH檢測(cè)采用ELISA方法，試劑盒購(gòu)自廣州市康潤(rùn)生物科技有限公司，產(chǎn)品編號(hào)為KR-AMH-001，屬于三步雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)。理論上，生物素-抗體與固相抗體-抗原復(fù)合物結(jié)合之后，再與鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物結(jié)合。這樣的抗體-抗原-抗體生物素復(fù)合物-SHRP結(jié)合在微孔上，通過(guò)酶-底物顯色反應(yīng)。酶和底物反應(yīng)程度由主波長(zhǎng)為450nm，參考波長(zhǎng)為620/630nm的雙波長(zhǎng)來(lái)測(cè)定，測(cè)得的吸光度（A值）反應(yīng)了樣品與校準(zhǔn)品中的抗苗勒氏管激素（AMH）的濃度，且成正相關(guān)，通過(guò)建立A值與濃度二者對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算待測(cè)樣本的AMH濃度。最低檢測(cè)量不高于0.06ng/mL，三個(gè)批號(hào)試劑盒之間檢測(cè)濃度的變異參數(shù)CV≤15%（n=10）。采用北京普朗新技術(shù)有限公司DNM-9602酶標(biāo)儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)步驟均嚴(yán)格按試劑盒及儀器說(shuō)明書(shū)操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

研究數(shù)據(jù)利用Excel錄入存檔，選用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)的以（±s）描述，偏態(tài)分布的AMH值由第5、10、90、95百分位數(shù)、中位數(shù)進(jìn)行表示。多組間比較采用方差分析，雙變量相關(guān)性分析使用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)，組間兩兩比較以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。選擇最優(yōu)回歸模型分析平滑擬合曲線作圖。

2 結(jié)果

2.1 年齡與AMH值的基本信息和相關(guān)性分析

納入研究共2986例患者，其中A組（634例）、B組（835例）、C組（615例）、D組（470例）、E組（432例），年齡17～51歲，平均（31.2±8.2）歲。可以從表1得出，A組（≤25歲）、B組（26≤X＜30歲）、C組（30≤X＜35歲）、D組（35≤X＜40歲）、E組（≥40歲）中位數(shù)比較，A組＞B組＞C組＞D組＞E組。經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，兩者均不符合正態(tài)分布，故選用Spearman相關(guān)，r=-0.562，P＜0.0001。相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果提示，年齡與AMH值之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，可認(rèn)為隨著年齡越大，AMH值會(huì)越小。見(jiàn)表1，圖1。

2.2 各年齡段與AMH值之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

表1 各個(gè)年齡段分組的AMH值變化

圖1 各個(gè)年齡段分組的AMH值變化散點(diǎn)圖（縱軸：抗苗勒管激素AMH；橫軸：年齡）

表2 各年齡組間AMH值的差異比較

2.3 AMH與年齡相關(guān)的回歸模型分析

以AMH值為因變量，年齡為自變量分別進(jìn)行線性、對(duì)數(shù)曲線、倒數(shù)、二次曲線、三次曲線、復(fù)合曲線、增長(zhǎng)曲線、指數(shù)曲線、逆函數(shù)、冪函數(shù)、邏輯函數(shù)等曲線擬合，最終判斷增長(zhǎng)曲線為最優(yōu)擬合曲線。由表3擬合結(jié)果寫(xiě)出增長(zhǎng)曲線擬合方程，其中Y代表AMH值，X代表年齡，R2為確認(rèn)系數(shù)，也就是模型擬合的相關(guān)指數(shù)擬合度；B代表線性回歸中的B系數(shù)，見(jiàn)表3及圖2。

表3 增長(zhǎng)曲線擬合結(jié)果

由表3擬合結(jié)果寫(xiě)出增長(zhǎng)曲線擬合方程Y=e5.131-0.133X，其中Y代表“結(jié)果”，X代表年齡。

圖2 AMH值與年齡的散點(diǎn)圖及AMH隨年齡變化的平滑擬合曲線

3 討論

3.1 抗苗勒管激素與傳統(tǒng)檢測(cè)方法的比較

女性生殖功能是隨著青春期、生育期、圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)期逐漸變化的，所以卵巢功能儲(chǔ)備的檢測(cè)，對(duì)于臨床醫(yī)生指導(dǎo)患者選擇治療方案和評(píng)估臨床預(yù)后極其重要。（1）傳統(tǒng)的卵巢功能評(píng)估方法包括經(jīng)期基礎(chǔ)內(nèi)分泌的測(cè)定（FSH、LH、E2）、抑制素B（inhibin，InhB）、竇卵泡（AFC）[1]。由于機(jī)體內(nèi)環(huán)境相互作用，F(xiàn)SH、InhB和AFC可能對(duì)于無(wú)變化的排卵期婦女，無(wú)法預(yù)知她們的卵巢儲(chǔ)備功能。Meczekalski等[6]認(rèn)為即使對(duì)于這類(lèi)女性，AMH雖然有所波動(dòng)，但是仍然可以提示卵巢功能變化，較傳統(tǒng)方法更為早期、準(zhǔn)確[7-8]。（2）AMH由竇前卵泡和小竇狀卵泡的顆粒細(xì)胞分泌，抑制始基卵泡的的募集，調(diào)節(jié)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育[3，9]，且不受下丘腦-垂體-卵巢軸的調(diào)控，反映的是連續(xù)生長(zhǎng)竇卵泡數(shù)量，在經(jīng)期任意一天抽血都可檢測(cè)。La Marca等[10]認(rèn)為AMH其活性不僅存在于進(jìn)入周期的卵泡中，同時(shí)也存在于其他未進(jìn)入周期卵泡中，可以預(yù)測(cè)卵巢反應(yīng)性，且不受FSH影響。為卵巢功能測(cè)定提供了客觀依據(jù)，也為AMH評(píng)估卵巢功能提供預(yù)測(cè)性?xún)?nèi)分泌學(xué)指標(biāo)。（3）AMH較傳統(tǒng)檢測(cè)有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，任妞等[11]分別檢測(cè)卵泡期及黃體期AMH水平變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示無(wú)顯著差異，說(shuō)明AMH重復(fù)性好，穩(wěn)定性強(qiáng)，經(jīng)期各時(shí)段波動(dòng)不大，具有更強(qiáng)的臨床運(yùn)用價(jià)值。（4）AMH還可以預(yù)測(cè)受孕結(jié)局，陳華干等[12]對(duì)比隨訪自然妊娠女性與非妊娠女性的AMH變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)妊娠婦女AMH明顯高于非妊娠婦女（P＜0.05），可能這與卵巢儲(chǔ)備功能好、卵細(xì)胞質(zhì)量好有關(guān)。

3.2 抗苗勒管激素與年齡之間的關(guān)系

目前，國(guó)內(nèi)在對(duì)于年齡研究中發(fā)現(xiàn)，女性在月經(jīng)初潮建立到20歲生育能力趨于靜止?fàn)顟B(tài)，30歲后開(kāi)始下降，50歲后卵巢重量和體積均會(huì)明顯下降，卵巢功能呈指數(shù)衰減[13]。Tremellen等[14]研究認(rèn)為37歲時(shí)AMH值可降至1.43μg/L。張秀萍[15]研究發(fā)現(xiàn)年齡＞30歲時(shí)AMH開(kāi)始下降，尤其當(dāng)≥35歲后，AMH水平呈直線下降，與AFC及獲卵率呈正相關(guān)。本研究中，我們將參與研究的女性分為A組（≤25歲）、B組（26≤X＜30歲）、C組（30≤X＜35歲）、D組（35≤X＜40歲）、E組（≥40歲），相關(guān)性分析中可以得出AMH與年齡呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，年齡越大，AMH值越低，與Faddy[16]、劉海玲[17]研究結(jié)論一致。組間兩兩進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），AMH值隨年齡增加逐漸減小。最后對(duì)年齡和AMH值進(jìn)行回歸模型分析，最終判斷增長(zhǎng)曲線為最優(yōu)擬合曲線，可以更好的反映AMH值與年齡之間的變化過(guò)程。關(guān)于AMH值與女性年齡之間的關(guān)系和預(yù)測(cè)卵巢功能的臨床運(yùn)用價(jià)值，目前國(guó)內(nèi)外研究較少，本研究的優(yōu)點(diǎn)在于有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量范圍，專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員操作，樣本量大，很大程度上避免了選擇和信息偏倚。

3.3 抗苗勒管激素在評(píng)估卵巢功能中的運(yùn)用價(jià)值

國(guó)內(nèi)外學(xué)者在探討AMH在ART中臨床運(yùn)用價(jià)值時(shí)發(fā)現(xiàn)，AMH對(duì)試管嬰兒（in vitro fertilization，IVF）成功率、多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）、卵巢過(guò)度刺激綜合征（ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS）等方面都有至關(guān)重要的作用。（1）2010年美國(guó)疾病預(yù)防控制中心（centers for disease control and prevention，CDC）在對(duì)147 260個(gè)IVF周期中發(fā)現(xiàn)女性年齡在＞35歲以后IVF成功率直線下降[18]。2013年Broer等[19]在對(duì)接受ART治療中的女性患者年齡及妊娠率進(jìn)行META分析，結(jié)果顯示每增加1歲，其IVF成功率降低6%。同時(shí)，AMH及年齡也是預(yù)測(cè)IVF成功率的重要獨(dú)立指標(biāo)。Revell等[20]對(duì)AMH 0.5ng/mL的361名女性448個(gè)IVF治療周期回顧性分析，隨著年齡增加，成熟卵母細(xì)胞數(shù)會(huì)逐漸減少，且兩組之間有顯著性差異。（2）王海燕等[21]在檢測(cè)不同年齡段接受體外受精-胚胎移植的不孕患者的血清抗苗勒管激素水平（AMH）中認(rèn)為， AMH水平雖與妊娠率呈正相關(guān)，但是需要結(jié)合年齡綜合考慮對(duì)試管嬰兒臨床結(jié)局進(jìn)行預(yù)測(cè)。Weenen等[22]發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)OHSS高危風(fēng)險(xiǎn)的血清AMH值也是正常反應(yīng)患者的數(shù)倍。有趣的是，在研究克羅米芬（clomifene citrate，CC）促排試驗(yàn)時(shí)，Cui等[23]發(fā)現(xiàn)AMH相對(duì)較高的PCOS女性可能需要更大劑量的CC啟動(dòng)劑量才能獲得相等的妊娠成功率，這可能與AMH抑制始基卵泡生長(zhǎng)有關(guān)。而本研究不足的是缺少傳統(tǒng)方法和年齡之間關(guān)系的比較，以及對(duì)IVF臨床妊娠結(jié)局的追蹤和分析，仍舊需要大量樣本進(jìn)行前瞻性研究和結(jié)局追蹤，這將是本實(shí)驗(yàn)下一個(gè)研究的方向。抗苗勒管激素（AMH）與年齡呈負(fù)相關(guān)，并且隨著年齡增加可以預(yù)測(cè)卵巢功能也隨之減退，對(duì)ART技術(shù)選擇和臨床備孕指導(dǎo)都具有非常重要的運(yùn)用價(jià)值。